生物破乳劑的主要制備過程可分為生產菌的篩選、發酵生產、提取和純化。

　　1.生物表面活性劑的種類及生產菌

　　生物表面活性劑已有20多年的發展歷史,通過發酵,在一定條件下的微生物細胞可生產生物表面活性劑。按結構特點,生物表面活性劑基本上可以分為6大類。

　　2.分離生物表面活性劑生產菌的方法

　　生物表面活性劑的生產首先依賴于生產菌,不同的生產菌產生不同的生物表面活性劑,如何快速而有效地篩選和分離出表面活性劑生產菌,是人們研究的一個熱點,現有菌株的篩選和分離主要有以下幾種方法。

　　(1)表面張力法

　　生物表面活性劑具有表面活性,因此可通過檢測微生物的液體培養液是否具有表面活性來篩選生物表面活性劑產生菌。這種方法在菌種初篩過程中比較麻煩,但卻能很好地反映出菌株在一定培養條件下產生生物表面活性劑的能力。

　　(2)界面張力法

　　因為生物表面活性劑能降低油水間界面張力,通過界面張力儀和其他儀器檢測菌體培養液加入前后油水兩相間界面張力的變化來確定菌體產生生物表面活性劑能力的大小。能降低油水間界面張力的即為生物表面活性劑的產生菌。此法也是一種有效檢測菌體產生生物表面活性劑能力大小的方法。

　　(3)血平板法

　　血平板法是利用生物表面活性劑的溶血特性來篩選產生生物表面活性劑的菌株。血平板培養基可采用在普通的細菌、真菌培養基加入一定濃度的羊血滅菌后制成平板,通過平板劃線或涂平板的方法將富集培養液接種于血平板上,培養幾天后挑取有溶血圈的菌落作進一步的研究。這種方法的優點是比較方便直觀,可以用大量的菌種篩選工作,根據溶血圈與菌落之比來判斷菌體產生生物表面活性劑的能力;缺點是如果血平板制作不好則不易發現溶血圈,直接影響到實驗結果的觀察。

　　(4)原油平板法

　　表面活性劑具有兩親性或乳化原油的特性,因此,可以通過菌體在原油平板形成乳化圈的大小來確定菌種是否產生生物表面活性劑以及其產生生物表面活性劑的能力大小。這種方法非常適合也只適合能利用石油烴類物質產生生物表面活性劑的微生物。

　　(5)液滴法

　　液滴法是利用96孔板快速大量檢

　　測表面活性劑生產菌的一種方法。此法可以檢測菌體產生生物表面活性劑的數量和質量。該法具有結果明顯易觀察的特點,同時可以進行多個樣品的測量,但缺點是樣品準備比較麻煩。

　　(6)傅里葉變換紅外光譜法

　　不同的生物表面活性劑結構不同,但它們都至少存在酯鍵或羥基基團,這些基團常使化合物在紅外光譜中有很強的光吸收能力。所有的生物表面活性劑由于有C!O的存在,在1720cm-1和1770cm-1有強的吸收峰,因此,可以用來判斷菌體是否產生生物表面活性劑。傅里葉變換紅外光譜法被證明是一種快速有效的方法,在測量時加入內標物,可以定量的測量生物表面活性劑的產量。但這種篩選方法較為復雜,不適合大規模的菌種篩選工作。具體聯系污水寶或參見http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。

　　生物表面活性劑的提取

　　目前,生物表面活性劑工業規模的應用與合成的表面活性劑相比并不具有優勢,主要由于生物表面活性劑的生產費用較高,而產物提取費用占生產費用的大部分。生物表面活性劑在發酵液中的低濃度和兩親性妨礙其有效分離,常用提取方法有以下幾種。

　　(1)萃取

　　溶劑萃取是一種常用的提取方法,常用萃取有機溶劑有甲醇、乙醇、戊烷、丙酮、氯仿、二氯甲烷,這些溶劑可單獨使用,也可混合使用。MariasKuyukina等用甲基-叔丁基醚萃取Rhodococcus產生的生物表面活性劑,結果表明,甲基-叔丁基醚作為萃取劑可以取得較高的產品收率(10g/L),高效率(臨界膠束濃度為130~170mg/L),同時產品具有良好的表面活性(表面張力和界面張力分別為29mN/m和0.9mN/m)。甲基-叔丁基醚具有低毒、可生物降解、易回收、不易燃及不易爆炸等優良特性。(2)結晶與沉淀

　　結晶與沉淀是利用樣品組分中各組分在溶劑中的溶解度差異,使某些組分從溶液中生成結晶分離出來,是純化物質的一種很有效的方法,用離心或過濾取出沉淀物,必要時可再溶解后,用重結晶或重沉淀進一步純化。如Emulsm或由Torulopsis-petrophilum生產的蛋白質乳化劑均可以由在上清液中加入(NH4)2SO4沉淀得到。

　　(3)超濾

　　超濾是基于一種半透性薄膜,使溶液中的某些組分通過,而阻止或截留其他組分的分離方法。這種方法速度快、回收率高,在國外應用較為廣泛。Sung-chyrLin等用分子量截止值(MWCO)為30000D的超濾膜對Bacilluslicheniformis的變異體產生的生物表面活性劑進行了提取分析,同時還使超濾和高效液相色譜相結合,設計了一套對生物表面活性劑的提取、分析方法。

　　(4)泡沫分離

　　微生物的發酵過程中都會產生泡沫現象,產生表面活性物質的過程中尤其顯著。泡沫是由于快速攪動及向好氧微生物培養液中充氧而產生的,在表面活性物質存在的情況下穩定下來。利用這些泡沫來回收表面活性物質,可能是一種既經濟又合理的方法。Davis等用泡沫分離法對一類生物表面活性劑Surfactins進行了提取和濃縮,證明了泡沫分離是一種有效的生物表面活性劑分離方法,而且使泡沫分離和發酵過程相結合,建立了連續的生產過程。

　　(5)柱色譜

　　柱色譜法是基于混合物組分在固定相和流動相之間分配平衡的差異而實現的,柱色譜法一般與萃取和薄層色譜配合使用,如從發酵液中分離提純鼠李糖脂,可得到較純的物質。

　　(6)薄層色譜法

　　薄層色譜法是把吸附劑平鋪在一種載體上成一薄層作固定相,以不同的溶劑做流動相,靠吸附中的毛細現象,沿著一定方向移動,使樣品中的各組分在薄層中的吸附劑和展開劑之間,由于吸附與解吸的性質差異而得以相互分離。薄層色譜法可以對生物表面活性劑定性和定量的分析,但通常需要花費大量的時間進行預純化,如沉淀和有機萃取。

　　(7)高效液相色譜

　　高效液相色譜法是用極細顆粒的填充物作為固定相,采用高壓泵輸送流動相,是一種具有很高分離效率的儀器分析法。其突出的優點是分析速度快、柱效高、檢測靈敏度高、定量分析的準確度高。SungChyrLin[13]等人提出了一種分析和純化生物表面活性劑的改進高效液相色譜方法,通過比較原培養液、超濾濾液及在原培養液中加入甲醇后的超濾濾液的色譜圖,在沒有任何生物表面活性劑結構信息的情況下,就可以鑒定相應生物表面活性劑的峰。適用于生物表面活性劑化學結構的表征及物理性質的鑒定。分離、提純生物表面活性劑的方法多種多樣,往往不是單一的方法,而是根據實際情況,使用幾種方法,這樣可以得到較好的效果。