高含鹽廢水的種類很多, 石油、頁巖氣開采, 電鍍、制藥、印染、發酵工業、海產品加工廢水等都含有較高濃度的無機鹽組分如Cl-等.生物處理方法是目前廣泛采用的高鹽廢水處理方法, 雖然高含鹽廢水中較高的鹽度會影響生物處理的效果, 但若采用其他的方法, 如膜分離等技術則成本較高, 所以生物處理仍是首選的處理方法.鹽度影響生物處理效果的主要原因在于：在生物處理方法中, 主要是利用活性污泥或生物膜、顆粒污泥中微生物的新陳代謝來吸附降解廢水中的污染物, 而高鹽度會引起高滲透壓, 使微生物細胞脫水, 同時也會抑制微生物降解有機物的反應效率, 從而影響生物處理方法的效果.因此, 在處理高含鹽廢水時應當選擇能夠耐受高鹽度影響的生物反應器.

　　迄今為止, 已進行過鹽度影響實驗研究的生物反應器有膜生物反應器、移動床生物膜反應器、升流式厭氧污泥床(up-flow anaerobic sludge blanket, UASB)反應器、上流式厭氧生物濾池反應器、EGSB反應器等, 由于顆粒污泥在鹽度負荷沖擊下能夠體現出更高的適應能力, UASB等能夠培養出厭氧顆粒污泥的生物反應器得以在處理高含鹽廢水時有更多的應用研究, 但同時從反應器處理效果和微生物角度分析研究較少. EGSB是在UASB基礎上發展起來的第三代厭氧反應器, 與UASB相比有更好的運行效果.本次研究利用模擬的高鹽度廢水, 從鹽度影響下EGSB反應器的運行效果和厭氧顆粒污泥兩個方面進行分析比較, 并對厭氧顆粒污泥做高通量測序, 以期為EGSB反應器應用于高含鹽工業廢水的實際處理提供參考的實驗數據.

　　1 材料與方法1.1 實驗裝置

　　實驗用EGSB反應器由圓筒形有機玻璃制成, 總高1.4 m, 內徑0.12 m, 總容積為15.52 L, 有效容積為15.18 L.回流口在距反應器底部1.19 m的位置, 三相分離器圓環擋板距離頂部0.16 m, 三相分離集氣罩呈圓錐形, 底部直徑0.1 m, 頂部直徑0.03 m, 高0.08 m, 排氣通道高0.07 m, 集氣罩、排氣通道和EGSB反應器上蓋密閉.投加顆粒污泥于反應器中, 進水和回流分別通過蠕動泵從反應器底部進入.顆粒污泥、沼氣、廢水三相在反應器中混合, 隨著水流上升至三相分離器, 沼氣進入集氣罩, 而大部分廢水通過集氣罩與擋板間的縫隙進入出水區, 顆粒污泥由于重力作用, 在遇到擋板和集氣罩壁后, 下降至污泥層, 因此能很好地實現氣、液、固的三相分離.

　　1.2 實驗用水

　　人工配置的模擬高鹽廢水用于本次實驗, 通過進水中逐漸增加的鹽度對EGSB反應器進行馴化.人工配水主要由葡萄糖、NH4Cl、KH2PO4、NaHCO3、NaCl和營養液配制而成, 葡萄糖、NH4Cl、KH2PO4分別作為人工配水中微生物生長代謝所必須的C、N、P源, 三者的投加量比例為C:N:P=250:5:1, 后期調整為125:5:1.采用NaCl提供人工配水中的鹽度, 對微生物進行鹽度馴化, 其投加量逐漸由0增加到7500 mg ·L-1.營養液中包含微生物生長所需要的微量元素, 其組成成分詳見表 1.

　　表 1 營養與組成成分

　　　　1.3 分析項目及方法

　　COD采用快速測定法, 測定儀器為5B-3(C)型COD快速測定儀(中國連華科技); 濕式氣體流量計用于計量沼氣產量; 顆粒污泥粒徑分布用濕式篩分法測定; 顆粒污泥沉降速度采用重量沉降法.

　　厭氧顆粒污泥高通量測序：按照OMEGA公司的E. Z. N. ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒說明書中的步驟提取厭氧顆粒污泥微生物中的DNA, 用瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性.細菌PCR擴增采用引物為341F:CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG, 805R:GACTG GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVG GGTATCTAATCC.古菌引用槽式PCR擴增有三輪, 第一輪使用引物為340F：CCCTAYGGGGY GCASCAG, 1000R：GGCCATGCACYWCYTCTC, 第二輪引物為349F：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode) GYGCASCA G KCGMGAAW, 806R：GAC TGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACV SGGGTATCTAAT, 第三輪擴增, 引入Illumina橋式PCR兼容引物. PCR結束后, 將PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測, DNA純化回收, 利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量, 以方便按照1 :1的等量混合后測序.委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序, 測序數據通過質量控制預處理, 去除嵌合體及靶區域外序列后, 在OTU聚類結果的基礎上進行RDP分析.預處理采用的軟件為Prinseq(版本0.20.4) 與FLASH(版本1.2.3), 去除嵌合體及靶區域外序列采用的軟件為Mothur(版本1.30.1), 分類采用的軟件為RDP classifier.

　　1.4 實驗方法

　　實驗通過調整EGSB反應器進水中Cl-的濃度來增加反應器鹽度負荷, 在0鹽度下連續啟動反應器后分4個階段逐步提高進水中Cl-的濃度, 各階段進水中Cl-濃度依次為2000、3500、5000和7500 mg ·L-1.在每個階段測定反應器的進出水COD值、容積產氣率、厭氧顆粒污泥的粒徑分布和沉降速度.對Cl-濃度為0和5000 mg ·L-1兩個階段的厭氧顆粒污泥進行高通量測序和宏基因組分析.

　　接種的厭氧顆粒污泥來自于某飲料生產企業的污水處理站UASB反應器中形成的顆粒污泥, 接種顆粒污泥體積占EGSB反應器總容積的50%.反應器水力停留時間(hydraulic retention time, HRT)為24 h, 回流比R為6 :1, 反應器溫度使用電阻絲溫控器控制在(35±2)℃, 進水pH值維持在6.8~7.2, 進水COD濃度維持在3267mg ·L-1, COD容積負荷為3.267kg ·(m3 ·d)-1.

　　2 結果與討論2.1 鹽度對COD降解的影響

　　EGSB反應器在控制進水COD濃度、進水COD容積負荷、pH等因素基本不變的運行條件下受不同鹽度(以Cl-濃度計)影響, COD降解效率的變化情況如圖 1所示.

圖中a、b、c、d、e這5個部分的進水Cl-濃度依次為0、2000、3500、5000、7500 mg ·L-1, 在反應器啟動后的114 d Cl-濃度曾調整為10000 mg ·L-1, 隨即停止進水, 3 d后又恢復到7500 mg ·L-1(圖中以虛線標示), 下同

圖 1 COD降解效率的變化

　　Cl-濃度低于7500 mg ·L-1時EGSB反應器的COD降解效率受到的影響不大, 適當地提高鹽度更能促進COD的降解, 這一點與劉峰等[11]的上流式厭氧生物濾池實驗結果相似.反應器完成啟動后, COD平均去除率為76.2%, 出水的COD平均濃度為699.2 mg ·L-1.當進水的Cl-濃度為2000 mg ·L-1, COD去除率略有降低, 但與前一階段相比仍有升高, 且仍然呈增長趨勢, 平均去除率為79.2%, 出水的COD平均濃度為678.25mg ·L-1.當進水的Cl-濃度提升到3500 mg ·L-1, 反應器的COD去除率未受到顯著影響, 持續升高, 平均去除率達到87.7%, 出水的COD平均濃度為401.9mg ·L-1.反應器在2500 mg ·L-1和3000 mg ·L-1的Cl-濃度下COD去除率都能保持較快的增長速率, 并且在3500 mg ·L-1的Cl-濃度下去除率增長比前一階段更快.反應器運行的第51 d開始, 進水的Cl-濃度增加到5000 mg ·L-1, 反應器COD去除率有所降低, 但仍然能維持在80%以上, 整個階段中COD去除率在波動中逐漸上升, COD平均去除率為90.5%, 出水COD平均濃度為307.1mg ·L-1; 考慮到出水COD濃度波動較大, COD去除率應有進一步提高的空間, 在反應器運行第91 d對進水條件做出調整, 將進水中N、P濃度增加一倍，為反應器中微生物增加氮源磷源的供應.當進水的Cl-濃度進一步調整到7500 mg ·L-1, 反應器的COD平均去除率為98.1%, 沒有明顯波動, 出水的COD平均值為61.08mg ·L-1; 因為COD去除率在7500 mg ·L-1的進水Cl-濃度下沒有受到影響, 在反應器啟動的第114 d曾一度將進水Cl-濃度提升到10000 mg ·L-1, 但在調整次日EGSB反應器中的厭氧顆粒污泥即出現了嚴重的上浮流失現象, 隨即停止進水, 2 d后將進水Cl-濃度恢復為7500 mg ·L-1.由于調整及時, 在此期間的COD降解并未受到很大影響, 反應器也很快恢復如前.在5000 mg ·L-1的Cl-濃度下, EGSB反應器經過接近2個月的馴化后COD的降解能力還能進一步提高, Cl-濃度達到7500 mg ·L-1時, 反應器的COD去除率能夠不受影響穩定維持在最高水平.

　　2.2 鹽度對容積產氣率的影響

　　容積產氣率主要反映了厭氧反應器的產沼氣情況, 其在很大程度上反映了厭氧反應器的有機物降解情況.

　　當進水Cl-濃度在7500 mg ·L-1以下時, 反應器的容積產氣率隨鹽度的提升會在出現一定的波動后逐漸提升, 最終穩定維持在一個較高水平.從圖 2可以看出, 在a、b段, 反應器的容積產氣率都比較穩定, 沒有太大變化, 平均為0.91 m3 ·(m3 ·d)-1. 42 d后, 隨著Cl-濃度增大到3500 mg ·L-1, 容積產氣率波動很大, 但整個階段的平均值比前一階段有增長, 為1.19 m3 ·(m3 ·d)-1; 結合同階段COD去除率的變化可見, 與整體的厭氧消化過程相比, 產甲烷過程對鹽度的變化更敏感.當Cl-濃度為5000 mg ·L-1, 反應器的容積產氣率在初期有下降趨勢, 在延長馴化時間并調整進水N、P濃度后, 容積產氣率又逐漸上升, 整個階段的平均值為1.39 m3 ·(m3 ·d)-1; 這個階段的變化趨勢與COD去除率的變化相近.在圖中e段, 反應器的容積產氣率在7500 mg ·L-1的Cl-濃度下略有下降, 經過一段時間馴化后, 反應器的容積產氣率又逐漸回復到原來的水平, 維持在1.63 m3 ·(m3 ·d)-1左右.

圖 2 容積產氣率的變化

　　反應器的容積產氣率受到鹽度影響的變化情況與COD降解的變化情況比較相似, 在鹽度提升時會受一定影響, 而持續馴化一段時間后又逐漸恢復并能在原有水平上進一步提高; 不同的是鹽度變化對產氣的影響更大, 在圖 2中容積產氣率的數據波動很大, 不如COD降解率的變化平穩.

　　2.3 鹽度對厭氧顆粒污泥的影響

　　在反應器運行的不同階段分別取樣測定了反應器中厭氧顆粒污泥的粒徑分布與沉降速度參數, 粒徑分布與沉降速度能夠體現顆粒污泥整體狀態與降解性能, 作為反應器內厭氧污泥的主體, EGSB反應器中顆粒污泥的狀態是反應器運行效果的關鍵, 顆粒污泥的狀態與特性影響著厭氧反應器的處理效率、體系活性及系統穩定性等.

　　從圖 3及表 2可以看出, 在鹽度沖擊下, 大顆粒污泥受到影響解體為小顆粒污泥, 使小顆粒污泥所占的比重上升.當Cl-濃度增加到7500 mg ·L-1且短暫調至10000 mg ·L-1后, 粒徑在0.9~0.6 mm的顆粒污泥大量解體成為粒徑小于0.6 mm的微小顆粒污泥, 與前面的幾個運行階段相比變化較大.在徐英博等的實驗中, 顆粒污泥的粒徑分布在高負荷下也表現出相同的變化, 分析其原因為大顆粒污泥中微生物較為豐富, 結構復雜, 生長優勢明顯, 而0.9~0.6 mm顆粒污泥較易受影響出現解體, 粒徑減小.在其他較低鹽度下, 顆粒污泥粒徑分布變化可以保持在一個較小范圍內. Cl-濃度在0~7500 mg ·L-1變化時, 粒徑大于2 mm的大顆粒污泥所占的質量分數始終在50%以上, 并且在Cl-濃度調整到3500 mg ·L-1后, 粒徑大于2 mm的大顆粒污泥所占的質量分數還有較低增幅, 可見顆粒污泥在這個等級的鹽度負荷下適應良好.

圖 3 厭氧顆粒污泥照片

　　表 2 厭氧顆粒污泥粒徑分布(質量分數)/%

　　　　如圖 4所示, 同等粒徑范圍內厭氧顆粒污泥的沉降速度受鹽度影響不大, 粒徑大于0.9 mm的顆粒污泥的沉降速度始終在60 m ·h-1以上, 除粒徑大于2 mm的顆粒污泥外的其他粒徑較小的顆粒污泥的沉降速度都有一定的提升.研究表明, 廢水浮力隨鹽度增加而提升, 導致高含鹽量的體系可以在系統中保留更為密實的顆粒污泥, 而大顆粒污泥內部容易營養不足引起細胞自溶形成空腔, 從而密度下降, 影響沉降速度.

圖 4 顆粒污泥沉降速度的變化

　　2.4 鹽度對微生物群落多樣性的影響

　　為進一步分析鹽度對厭氧顆粒污泥體系中微生物群落多樣性的影響, 分別對Cl-濃度為0和5000 mg ·L-1兩個反應器運行階段的厭氧顆粒污泥進行高通量測序和宏基因組分析, 表 3、4及圖 5、6分別展示了2個階段中古菌和細菌在門水平和屬水平分類層面上的類群分布情況.

　　表 3 古菌門水平類群分布

　　表 4 細菌門水平類群分布

圖 5 古菌屬水平類群分布

圖 6 細菌屬水平類群分布

　　在鹽度的影響下, 微生物群落的優勢菌群變化很大. Cl-濃度為0時, 古菌中的優勢菌屬是Methanoregula與Methanothrix, 分別占總數的50.01%與32.59%, 而當Cl-濃度達到5000 mg ·L-1, 占據優勢的菌屬則是Methanobacterium(57.5%), Methanospirillum(21.9%)和Methanothrix(13.91%). Methanoregula屬于廣古菌門(β-Euryarchaeota)甲烷微菌目(β-Methanomicrobiales), 主要代謝底物是H2、CO2. Methanothrix之前曾用名是Methanosaeta, 屬于專性乙酸營養型產甲烷古菌, 有研究顯示Methanosaeta適于在高負荷下生長. Methanobacterium屬于廣古菌門甲烷桿菌目(β-Methanobacteriales), 可以利用H2、甲酸鹽、甲醇等底物生產甲烷, Methanospirillum屬于廣古菌門甲烷微菌目, 其主要代謝底物為甲酸. Methanoregula, Methanothrix, Methanobacterium, Methanospirillum等都是厭氧消化器中常見的產甲烷菌屬.

　　在細菌群中, Cl-濃度為0時的門水平上的主要菌群是β-Chloroflexi(23.86%), β-Proteobacteria(18.99%), β-Bacteroidetes(11.27%), 當Cl-濃度達到5000 mg ·L-1, 占據主體的菌群則變為β-Bacteroidetes(29%), β-Proteobacteria(23.17%)和β-Firmicutes(18.06%).在屬水平上沒有特別優勢的菌屬, 在兩個不同階段優勢最大的細菌分別是Longilinea(7.49%)與Paludibacter(7.69%). Longilinea屬于綠彎菌門(β-Chloroflexi)的厭氧繩菌目(β-Anaerolineales), 可代謝多種碳水化合物. Paludibacter屬于擬桿菌門(β-Bacteroidetes)的紫單胞菌科(β-Porphyromonadaceae), 能發酵多種單糖和二糖產丙酸、乙酸和少量丁酸.當Cl-濃度為0時, 在細菌的測序分析中發現了古菌的β-Euryarchaeota, 因為細菌與古菌的16S rDNA基因序列有較高的同源性, 在對細菌測序分析時也有可能發現古菌, β-Euryarchaeota在Cl-濃度達到5000 mg ·L-1時在細菌的測序中不再占據優勢, 表明鹽度的增高影響了古菌的生長.具體參見污水寶商城資料或http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。

　　3 結論

　　(1) 在COD容積負荷為3.267kg ·(m3 ·d)-1的運行條件下, EGSB反應器在Cl-濃度小于7500 mg ·L-1時運行效果較好, 隨著Cl-濃度的提高, 反應器運行效果基本表現出波動后提升的變化.最終Cl-濃度在7500 mg ·L-1時, 反應器的COD平均去除率在98.1%, 容積產氣率能夠基本穩定在1.3 m3 ·(m3 ·d)-1以上.在鹽度馴化后, 適當提高鹽度能夠提高反應器的運行效果.

　　(2) 保持反應器COD容積負荷為3.267kg ·(m3 ·d)-1, 反應器中的厭氧顆粒污泥對于0~7500 mg ·L-1范圍內的Cl-濃度體現出良好的適應性, 大顆粒污泥在鹽度提升的影響下仍然占據反應器顆粒污泥的主體, 而在Cl-濃度短暫提升到10000 mg ·L-1的沖擊下, 粒徑較小的顆粒污泥容易受到影響, 出現解體現象.同等粒徑范圍內厭氧顆粒污泥的沉降性能在高鹽廢水的影響下有小幅度的提升, 并且大顆粒污泥的沉降速度保持在60 m ·h-1以上.

　　(3) 鹽度影響了厭氧顆粒污泥中微生物的類群分布, 群落中優勢菌群的變化很大.當Cl-濃度由0增加到5000 mg ·L-1, 古菌群中的優勢菌群由Methanoregula(50.01%)和Methanothrix(32.59%)變為Methanobacterium(57.5%), Methanospirillum(21.9%)和Methanothrix(13.91%); 細菌群中, 原本數量較多的Longilinea(7.49%)受鹽度影響豐度降低, Paludibacter(7.69%)成為占據優勢的菌群.