申請日2015.07.22

　　公開(公告)日2016.01.20

　　IPC分類號G01N33/18

　　摘要

　　本方法公開了一種測定含氯消毒廢水中大腸桿菌殘留的新方法，包括以下步驟：1)先測定水中游離余氯的量。2)根據游離余氯的值初步判定是否有大腸桿菌殘留的可能。3)向大腸桿菌有可能殘留的水樣中加入一定量濃度為0.11g/L的硫代硫酸鈉還原游離余氯。4)對水樣進行增菌、分離、生化鑒定，符合其特征的報告大腸桿菌檢出。本發明的方法簡單、易于操作，污染小，準確度高、干擾小。

　　權利要求書

　　1.一種測定合氯消毒廢水中大腸桿菌殘留的新方法，其特征包括如下步驟：

　　(1)對樣品先進行游離余氯的測定;

　　(2)根據游離余氯的值是否達到臨界點來判定是否有大腸桿菌殘留;

　　(3)如果游離余氯的值小于臨界點，則向每升水樣中加入1mL濃度為0.11g/L的硫代硫酸鈉溶液，還原游離余氯;

　　(4)取水樣10mL于10mL雙倍乳糖蛋白胨培養液中，平行接種五份，36℃±1℃培養24h ±2h，如未產酸產氣則繼續培養24h，對產酸產氣管劃線分離于伊紅美藍瓊脂平板， 36℃±1℃培養24h±2h，挑取典型和可疑菌落進行IMViC(用來測定菌的生化特征的4個實驗)生化鑒定和革蘭氏染色，符合其特征的判定大腸桿菌檢出;

　　(5)大腸桿菌殘留的臨界點是游離余氯的量為165mg/L，本處的臨界點指消毒時間大于 2h，水樣中菌落總數≤108cfu/mL;游離余氯的量大于165mg/L時，底定性檢測大腸桿菌無殘留。

　　2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，對每升水樣中加入1mL濃度為0.11g/L的硫代硫酸鈉溶液還原游離余氯。

　　說明書

　　一種測定含氯消毒廢水中大腸桿菌殘留的新方法

　　【技術領域】

　　本發明涉及水質生物檢測技術領域，具體涉及測定含氯消毒廢水中大腸桿菌殘留的新方法。

　　【背景技術】

　　大腸桿菌(dachangganjun)(Escherichiacoli)細菌門。細胞桿狀，直徑約1微米，長約2微米，兩端鈍圓，周身具鞭毛，可運動。革蘭氏染色陰性，不形成芽孢。菌落圓形，白色或黃白色，光滑而具閃光，低平或微凸起，邊緣整齊。最適條件下培養20分鐘可繁殖 1代。大腸桿菌是人和溫血動物腸道內普遍存在的細菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病，可能在腸中對合成維生素K起作用。但它侵入人體一些部位時，可引起感染，如腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等。人在感染大腸桿菌后的癥狀為胃痛、嘔吐、腹瀉和發熱。感染可能是致命性的，尤其是對孩子及老人。由大腸桿菌導致的疾病：一是腸道外感染。多為內源性感染，以泌尿系感染為主;二是急性腹瀉。某些血清型大腸桿菌能引起人類腹瀉。

　　大腸桿菌(escherichiacoli)一般不致病。但致病性大腸菌株能引起食物中毒。致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細胞，具有痢疾桿菌樣致病力。已知大腸桿菌有菌體(O)抗原170 種，表面(K)抗原近103種，鞭毛(H)抗原60種，因而構成了許多血清型。在引起人畜腸道疾病的血清型中，有腸致病性大腸桿菌(簡稱EPEC)、腸毒素性大腸桿菌(簡稱ETEC) 和腸侵襲性大腸桿菌(間稱EIEC)等之分，多數腸毒素性大腸桿菌都帶有F抗原。在170 種“O”型抗原血清型中約1/2左右對禽有致病性，但最多的是O1、O2、O78、O35四個血清型。另有產腸毒素大腸桿菌，其腸毒素有耐熱性及不耐熱性兩種，均能使人致病。腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157：H7感染性腹瀉是近年來新發現的危害嚴重的腸道傳染病，它除引起腹瀉、出血性腸炎外，還可發生溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性小板減少性紫癲(TTP) 等嚴重的并發癥。后者病情兇險，病死率高。

　　依據《中華人民共和國傳染病防治法》和《消毒管理辦法》(衛生部第27號令)的相關規定，生活及醫療污水必須經過無害化處理，才可以排放，其中常用的消毒處理方法有：加氯消毒，臭氧法消毒，次氯酸鈉法、二氧化氯法消毒等，而這些廢水、污水是大腸桿菌很重要的一個污染源，雖然經過消毒，但由于消毒的效果與水中菌液的濃度、作用時間、消毒劑的含量都有著重要的關系，即便是經過消毒的廢水，也可能有大腸桿菌的殘留，對于這些污水消毒處理的效果，有關單位會定期對其進行監測，對此有很大的檢測市場需求，而我國目前的水質檢測方法中只有生活飲用水GB5750.12-2006中有大腸桿菌的相關檢測，環保部標準HJ/T347-2007《水質糞大腸菌群的測定多管發酵法和濾膜法(試行)》中檢測的糞大腸菌群，廢水中未發現大腸桿菌的相關檢測方法。由于含氯消毒劑有強氧化性，如果參照生活飲用水的檢測方法來測定含氯消毒廢水中大腸桿菌，會使乳糖膽鹽培養液中的指示劑脫色，致使實驗無法操作，因此，建立一個準確可行的含氯消毒廢水大腸桿菌的測定方法非常必要。

　　本發明建立了一種檢測含氯消毒廢水中殘留的大腸桿菌新方法，雖然消毒劑對大腸桿菌的消毒效果很好，但由于其濃度、作用時間、菌的濃度都與消毒效果息息相關。本方法采用測定游離余氯的量來初步判定是否有大腸桿菌殘留，再對廢水中的余氯進行還原來測定大腸桿菌殘留。方法簡單，易于操作，污染小，準確度高。

　　【發明內容】

　　本發明的目的是解決含氯消毒廢水中大腸桿菌殘留測定的問題，用于檢測消毒廢水中大腸桿菌的殘留，避免大腸桿菌對環境水質的生物污染，本方法成本低，污染小，準確度高，能夠滿足檢測需求。

　　本發明公開了一種測定含氯消毒廢水中大腸桿菌殘留的新方法，具體采用下述技術方案：

　　(1)對樣品先進行游離余氯的測定，方法參照GB/T5750.11-2006《生活飲用水標準檢驗方法消毒劑指標》。

　　(2)根據游離余氯的值判定是否有大腸桿菌殘留可能。當游離余氯的含量小于等于 165mg/L時，大腸桿菌可能殘留，需要進一步檢測來確證。

　　(3)如果大腸桿菌有可能殘留，向每升水樣中加入1mL濃度為0.11g/L的硫代硫酸鈉溶液，還原游離余氯。

　　(4)取水樣10mL于10mL雙倍乳糖蛋白胨培養液中，平行接種5份，36℃±1℃培養24h ±2h，如未產酸產氣則繼續培養24h，對產酸產氣管劃線分離于伊紅美藍瓊脂平板， 36℃±1℃培養24h±2h，挑取典型和可疑菌落接種于IMViC(用來測定大腸桿菌的生化特征的4個實驗，參見GB4789.38-2012《食品衛生微生物學檢驗大腸桿菌計數》)進行生化鑒定和革蘭氏染色，符合其特征的判定大腸桿菌檢出。

　　(5)當游離余氯的量為165mg/L時是大腸桿菌殘留的臨界點，本處的臨界點指水樣的菌落總數為≤108cfu/mL，按《水和廢水監測分析方法》(第四版增補版)5.2.4方法操作，消毒時間大于2h。大于此值時，定性檢測大腸桿菌無殘留。

　　【具體實施方式】

　　下面對本發明做進一步詳細說明。

　　實施例1：

　　分析步驟：取營養肉湯300mL于無菌罐中，制備20罐，121℃滅菌15min，向每個無菌罐中加入一環(接種環)大腸埃希氏菌液，36℃培養24h后，對每個無菌罐進行編號，分別加入10%次氯酸鈉溶液，如下表所示：

　　將所有無菌罐放置2小時(消毒劑作用時間)后分別無菌取2mL用于測定游離余氯的值參照(GB/T5750.11-2006)，同時無菌取10mL于10mL雙倍乳糖蛋白胨中，平行接種5份， 36℃培養24h，觀察產酸產氣情況，未產酸產氣者繼續培養24h，將產酸產氣管挑取一環劃線于伊紅美藍瓊脂平板上，36℃培養24h，觀察有無典型菌落，挑取單個典型和可疑菌落接種于IMViC進行生化鑒定和革蘭氏染色，36℃培養24h后觀察結果，大腸桿菌的生化特征為靛基質陽性、甲基紅試驗陽性、乙酰甲基甲醇試驗陰性、檸檬酸鹽試驗陰性。具體結果如下表。

　　結果分析：當游離余氯的量為165mg/L時是大腸桿菌殘留的臨界點，本處的臨界點指水樣的菌落總數為≤108cfu/mL，按《水和廢水監測分析方法》(第四版增補版)5.2.4方法操作，消毒時間大于2h。大于此值時，定性檢測大腸桿菌無殘留。

　　實施例2：

　　分析步驟：無菌取經含氯消毒過的生活污水2mL測定游離余氯的值為164mg/L。判定有大腸桿菌殘留，向1L水樣中加入0.11g/L的硫代硫酸鈉溶液1mL，取10mL于雙倍乳糖蛋白胨中，同時平行接種5份，36℃培養24h后產酸產氣者，挑取一環劃線于伊紅美藍平板上， 36℃培養24h，觀察有黑色中心，帶金屬光澤的菌落，挑取5個單菌落接種于IMViC(用來測定大腸桿菌的生化特征的4個實驗)進行生化鑒定和革蘭氏染色，36℃培養24h后，靛基質陽性、甲基紅試驗陽性、乙酰甲基甲醇試驗陰性、檸檬酸鹽試驗陰性，革蘭氏染色為陰性無芽孢桿菌。符合大腸桿菌的特征，判定水樣中大腸桿菌檢出。

　　上述實施例僅供說明本發明之用，而并非是對本發明專利的限制;應當指出的是，對于本領域的普通技術人員，在不脫離本發明構思范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，這些都屬于本發明的保護范圍;因此，凡跟本發明權利要求范圍所做的變化與修飾，均應屬于本發明權利要求的覆蓋范圍。