由于抗生素的廣泛使用乃至濫用, 環境中殘留的抗生素對自然環境中的微生物群落產生了選擇性壓力, 使得抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)在環境中持久存在并廣泛傳播.目前ARGs已經成為了學術界的研究熱點, 大量研究表明ARGs廣泛存在于自然水環境中, 如河流、湖泊乃至海洋.廢水處理系統(wastewater treatment plants, WWTPs)是污染治理體系中的一個重要環節, 它匯集了人類生活和生產產生的大量生活污水、醫療污水和工業廢水等, 被認為是自然水環境中ARGs污染的重要點源, 且促進了ARGs的誘導和遷移, 因此, ARGs在不同類型的廢水處理系統中的分布特征得到了廣泛關注.制藥廢水處理系統(pharmaceutical WWTPs, PWWTPs)的進水中往往含有高濃度的抗生素及生產原料和中間體, 對生物處理單元的微生物群落形成高強度選擇性壓力, 為ARGs在污水中的持久存在和傳播擴散提供了有利條件, 一些研究證實制藥廢水處理系統的出水中ARGs的濃度高于市政污水處理系統的出水.制藥廢水處理后往往排入下水道, 與其他污水(主要包括未經處理的生活污水和經過處理的其它工業廢水)合并后再進入綜合性廢水處理系統(integrated WWTPs, IWWTPs), 進行統一處理后再排入水環境中.因此, 為了保護自然水生態安全, ARGs在制藥廢水和綜合性兩級廢水處理系統中的分布特征和去除效率應給予高度關注.
本研究選取了浙江省某精細化工園區內一家藥業集團的制藥廢水處理系統和接納該制藥廢水處理系統出水的綜合性廢水處理系統, 沿兩級廢水處理工藝流程采集污水和污泥樣品, 以8類共28種ARGs作為目標基因進行定性檢測, 并對高頻率檢出的7種ARGs和16S rRNA進行定量檢測, 分析ARGs在具有上、下游關系的兩座廢水處理系統中的分布特征和去除效果, 探索ARGs的去除機制.
1 材料與方法1.1 兩級廢水處理系統簡介
選取浙江省某精細化工園區的兩座廢水處理系統為研究對象, 它們分別是藥業集團的廢水處理系統(PWWTP)和園區綜合性廢水處理系統(IWWTP).該藥業集團是化學合成醫藥原料和獸藥原料的生產商, 主導產品為喹諾酮類抗菌藥、大環內酯類抗菌藥等抗生素類藥物, 其中鹽酸環丙沙星、恩諾沙星、阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素等產品在全球市場上占據優勢地位.該公司產生的廢水是典型的制藥廢水, 有機污染物濃度高(COD可達5000 mg ·L-1), 水質波動大, 可生化性較差.該公司的廢水處理系統采用A2O工藝, 設計處理能力為2400 m3 ·d-1, 實際處理水量約為1000 m3 ·d-1.制藥廢水經處理后排入園區下水道, 與園區其它工業廢水及周邊生活污水混合(工業廢水和生活污水的比例約為6 :4), 再進入園區綜合性廢水處理系統, 該處理系統主體工藝為氧化溝, 分厭氧段、缺氧段和好氧段運行, 設計處理能力為22.5萬m3 ·d-1, 目前實際處理水量約為11.5萬m3 ·d-1, 處理后出水排入臨近海域.
1.2 樣品采集及預處理
本研究的采樣時間是2015年4月, 兩座廢水處理系統的工藝流程示意圖和采樣點見圖 1, 采樣點具體包括:進水(P-Inf和I-Inf)、缺氧池出水(P-Ax和I-Ax)、好氧池出水(P-Ox和I-Ox)和二沉池出水(P-Eff和I-Eff).厭氧池出水由于取樣條件限制未取得.此外, 還采集了二沉池污泥樣品(P-Slu和I-Slu).每個采樣點采集了1 L水樣, 并存放于預先清洗干凈的無菌聚乙烯塑料瓶中, 冷藏運輸回實驗室后置于4℃保存.污泥樣品存放于無菌的塑料袋中, 冷藏運輸回實驗室后置于-20℃保存.
圖 1
1.3 樣品DNA提取
水樣中DNA的收集采用0.22 μm混合纖維素酯濾膜(Millipore, 德國)過濾截留方法, 污泥樣品則稱取約0.2 g轉移到潔凈的收集管中, 隨后二者均使用PowerSoil DNA Isolation Kit (Mo Bio, 美國)試劑盒進行DNA提取.提取完成后, 使用質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 (Thermo Fisher, 美國)對DNA濃度和純度進行檢測.
1.4 普通PCR檢測
本研究選擇了8類共27種ARGs進行定性檢測, 具體包括7種四環素類ARGs(tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetQ、tetW), 4種磺胺類ARGs(sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、sul Ⅲ 、sulA), 3種甲氧芐啶ARGs(dfrA 1 、dfrA 12 、dfrA 13 ), 3種β-內酰胺類ARGs(ampC、blaSHV、blaPSE- 1 ), 2種大環內酯類ARGs(ermA、ermB), 3種氯霉素類ARGs(cat Ⅰ 、cat Ⅱ 、floR), 2種氨基糖苷類ARGs[aac(3)-Ⅱ a、aac(3)-Ⅳ ]和3種萬古霉素ARGs(vanA、vanB、vanC).所用的引物序列和片段大小見表 1.本實驗所使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.普通PCR采用25 μL體系, 包含12.5 μL Premix Ex TaqTM Hot Start Version (TaKaRa, 中國); 各1 μL的上、下游引物; 1 μL的DNA模板; 9.5 μL ddH2O. PCR反應程序為: 95℃預變性3 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 共35個循環; 最后于72℃延伸10 min. PCR產物置于4℃保存, 并使用質量濃度為1%~2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.
表 1 PCR引物序列
1.5 實時熒光定量PCR檢測
根據普通PCR定性檢測的結果, 本研究對tetO、tetQ、tetW、sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、dfrA 13 、floR共7種ARGs及16S rRNA進行定量測定, 所用引物序列同表 1.采用SYBR Green Ⅰ方法、使用實時熒光定量PCR儀(BioRad CFX96 Touch, 美國)對各目標基因進行定量測定.定量PCR采用20 μL體系, 包含10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa, 中國), 引物各0.4 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 8.2 μL.反應程序為: 95℃預變性1~2 min; 95℃變性30 s, 退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40個循環.溶解曲線程序為55~95℃, 每0.5℃讀數一次, 期間停留30 s.測定時, 將標準質粒以10倍梯度稀釋, 再根據質粒濃度計算得到標準質粒的拷貝數, 與通過實時熒光定量PCR測定得到的Ct值對應可做出標準曲線, 標準質粒的構建方法參照張衍等[24]的研究.各目標基因的標準曲線的線性相關系數在0.988~0.999之間.每個樣品均設置3個平行樣, 以減少誤差.
1.6 數據分析
使用Excel 2016和Past3.0對數據進行分析, 相關性分析采用Pearson相關方法, P < 0.05(95%置信區間)被認為是顯著相關.
2 結果與討論2.1 兩座廢水處理系統進水中ARGs存在情況
在27種ARGs中, P-Inf中共檢出了10種ARGs, I-Inf中共檢出了15種ARGs, 結果如表 2所示.與P-Inf相比, I-Inf中的ARGs種類更為豐富.在檢出的ARGs中, 四環素類和磺胺類ARGs的檢出較為普遍, 甲氧芐啶類和大環內酯類ARGs有少量檢出, 而β-內酰胺類ARGs和萬古霉素類ARGs基本沒有檢出.檢測的7種四環素類ARGs包含3種抗性機制為編碼外排泵蛋白的tetA、tetB、tetC基因和4種編碼核糖體保護蛋白的tetM、tetO、tetQ、tetW基因, 而檢出的基因都屬于后者, 這說明編碼核糖體保護蛋白的四環素類ARGs更有可能存在于廢水處理系統中.
表 2 兩座廢水處理系統的進水中ARGs檢出情況1)
2.2 兩座廢水處理系統中ARGs的分布特征
兩座廢水處理系統采集的樣品中目標基因的絕對豐度分布情況如圖 2所示.在所有水樣中, 16S rRNA濃度為3.94×107~7.34×108 copies ·mL-1, 高出ARGs濃度0.55~4.58個數量級; 除P-Ax以外, 其余生物單元水樣中16S rRNA的濃度均高于進水和出水, 說明微生物在生物處理單元有效地增殖.在泥樣中, 兩座廢水處理系統的二沉池污泥中16S rRNA濃度均在1011 copies ·g-1水平, 遠高于水樣中16S rRNA的濃度水平.有報道指出6個PWWTP水樣中16S rRNA主要在105~108 copies ·mL-1的濃度水平, 與本研究結果一致.另有研究顯示, 在我國杭州、哈爾濱等地的市政污水處理廠的水樣中, 16S rRNA在108~1012 copies ·mL-1的濃度水平, 明顯高于制藥廢水處理系統水樣中的濃度水平.這意味著與市政污水相比, 制藥廢水和工業廢水對微生物群落產生了更高的選擇性壓力, 因此兩個廢水處理系統中微生物濃度下降.相關性分析結果顯示(圖 3), 兩座廢水處理系統水樣中16S rRNA濃度與7種ARGs總濃度顯著正相關(P < 0.01, r=0.884), 并且與sul Ⅰ (P < 0.05, r=0.818)和sul Ⅱ (P < 0.05, r=0.756)兩種磺胺類抗性基因顯著正相關, 說明廢水水樣中ARGs濃度受到微生物濃度變化的影響.具體聯系污水寶或參見http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。
圖 2
圖 3
有研究指出在PWWTP中, 相比于抗生素濃度, 微生物濃度是影響ARGs的更為重要的因素.在兩座廢水處理系統的進水中, ARGs濃度在1.79×103 copies ·mL-1(tetW, P-Inf)~6.14×103 copies ·mL-1(sul Ⅱ , I-Inf)之間, 其中, sul Ⅰ 和sul Ⅱ 基因絕對豐度最高, 隨后依次是dfrA 13 、tetQ、floR、tetO和tetW基因.兩座系統進水中ARGs相對豐度的分布順序與絕對豐度一致(圖 4), 仍舊是sul Ⅰ 和sul Ⅱ 基因最高, 隨后依次是dfrA 13 、tetQ、floR、tetO和tetW基因.有研究顯示, sul Ⅰ 和sul Ⅱ 基因以105~107 copies ·mL-1的絕對豐度存在于不同的市政污水處理系統的進水中, 濃度水平高于四環素類ARGs[25, 29, 30], 在制藥廢水處理系統中也有同樣的情況, 這與本研究的結果一致.四環素類ARGs中, tetO、tetQ和tetW基因在廢水處理系統中的分布較早地得到了關注, 在制藥廢水處理系統中也有研究.本研究對這3種四環素類ARGs的相關性分析顯示, tetO基因與tetW基因顯著正相關(P < 0.01, r=0.915), 而tetQ基因與tetO(P=0.27, r=0.442)、tetW(P=0.56, r=0.246)基因正相關但不顯著, 說明這3種四環素類ARGs在兩級廢水處理系統中的濃度水平具備相似性, 這可能與它們具備相同的抗性機制有關.與四環素類和磺胺類ARGs不同, 甲氧芐啶抗性基因dfrA 13 尚未有文獻報道存在于污水處理系統中.在本研究中, dfrA 13 的絕對豐度水平高于已有研究中檢出頻率較高的3種四環素類ARGs, 這表明僅著眼于四環素類和磺胺類ARGs等高頻率被檢出的ARGs類別, 對廢水處理系統中ARGs污染狀況的評估將是不全面的, 未來建議引入高通量qPCR、宏基因組等新技術進行更加細致全面的研究.
圖 4
P-Eff匯入I-Inf中, 再由IWWTP進行處理. IWWTP需處理多種來源的生活污水和工業廢水, 不同廢水對I-Inf中ARGs的貢獻不同.每天P-Eff和I-Inf水樣的ARGs總量如表 3所示(ARGs總量估算方法:水樣中ARGs單位體積濃度系統每日處理水量), 可以看到:每天P-Eff對I-Inf中總ARGs的貢獻率為5.05%, 而每天P-Eff的水量僅占I-Inf的0.87%, 說明PWWTP對IWWTP中ARGs污染貢獻較大.更進一步地, P-Eff對I-Inf中不同ARGs的貢獻率有較大差異, 貢獻率最高的為sul Ⅰ 基因, 達9.12%, 其后依次是floR、tetW、sul Ⅱ 、tetO、tetQ, 貢獻率最低的是dfrA 13 基因, 僅為0.17%.通過對水樣中ARGs物質流的分析, 可以厘清IWWTP中不同來源廢水的ARGs貢獻率, 為未來有針對性地控制ARGs污染源提供指導.
表 3 ARGs在兩座廢水處理系統中的傳輸
2.3 兩座廢水處理系統對ARGs的作用
在兩座廢水處理系統中, 總ARGs濃度在生物處理單元中升高, 經過二沉池的處理后, 出水中的總ARGs濃度下降, 其中ARGs濃度在1.27×103 copies ·mL-1(tetW, P-Eff)~3.31×106 copies ·mL-1(sul Ⅰ , P-Eff)之間.而二沉池污泥中, ARGs濃度在1.24×106 copies ·g-1(tetW, I-Slu)~6.19×109 copies ·g-1(sul Ⅱ , I-Slu)之間, ARGs濃度高于出水3~4個數量級(圖 2), 表明生物處理單元有可能促進ARGs的擴增和傳播; 大量的ARGs從水中轉移到了泥中, 表明二沉池的污泥沉降作用可能是去除污水中ARGs的主要機制.
廢水處理系統對ARGs能否有效去除目前尚有爭議.在中國北方的兩座污水處理廠中, ARGs被證實得到了明顯的擴增和傳播, 而在意大利的3座污水處理廠中, 大多數ARGs能夠被顯著地去除.在本研究中, 兩座廢水處理系統對ARGs的去除同樣表現出了差異(圖 5).總體來看, 經PWWTP處理后ARGs濃度上升了0.21個數量級, 未表現出對ARGs的去除效果, 經IWWTP處理后總ARGs濃度下降了1.03個數量級, 表明PWWTP對ARGs的去除效果相對較弱.進一步分析不同基因, PWWTP僅對tetQ、sul Ⅱ 和dfrA 13 基因有去除作用, 分別去除了0.48、0.23和0.79個數量級; 而IWWTP對除了floR外的基因均表現出了去除效果, 對tetO、tetQ、tetW、sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、dfrA 13 以及16S rRNA分別去除了0.92、2.01、1.56、0.83、1.20、0.64及0.98個數量級. IWWTP對四環素類ARGs表現出較好的去除效果, 這與浙江省、哈爾濱市、江蘇省多地的市政污水處理廠中的情況類似.在3種四環素類ARGs中, PWWTP和IWWTP對tetQ的去除效果最好, 這可能與tetQ基因在水環境中的遷移機制有關.有研究表明在這3種四環素類ARGs中, tetQ的遷移率最高, 推測其能夠快速地遷移到活性污泥中, 并隨著污泥沉降作用離開水體而得到去除.相比較之下, 磺胺類ARGs較難被廢水處理系統去除, 推測可能與這兩種基因均位于高效的水平轉移元件上有關[36].經PWWTP和IWWTP處理后, 氯霉素類抗性基因floR的濃度分別上升了1.70和0.25個數量級, 由圖 2可以看出, 相較于進水, floR基因濃度在好氧池出水中分別上升了1.12和1.05個數量級, 顯示其能夠在好氧環境中廣泛地擴增和傳播, 因此, floR基因在廢水處理系統中的分布值得重點關注.有研究關注了浙江省四座市政污水處理系統對ARGs的去除情況, 發現其對tetO、tetQ、tetW基因去除了2.0~3.5個數量級, 對sul Ⅰ 、sul Ⅱ 去除了1~2.5個數量級, 去除效果優于本研究中的兩座廢水處理系統, 這意味著與市政污水處理系統相比, 如何去除制藥廢水處理系統中的ARGs需要更多的關注.在作者團隊后期對該藥業集團廢水處理系統的調研中, 分別在系統進水、水解酸化池出水和好氧池出水中檢出了濃度為5.06、4.88和3.23 mg ·L-1的鹽酸環丙沙星[37], 表明廢水處理系統中存在高濃度的抗生素, 對微生物群落造成較大的抗生素選擇壓力, 很可能導致系統中出現高豐度的ARGs, 并使得系統中的ARGs較難被去除.
圖 5
本研究中的制藥廢水經PWWTP和IWWTP兩級處理后, 最終出水(I-Eff)將排入臨近海域, 可能對受納水體的微生物群落產生影響, 引起抗生素抗性的蔓延和傳播, 進而對人類健康產生潛在風險.此外, 高濃度的ARGs進入二沉池污泥中, 可能通過污泥處理和處置過程而在土壤環境中引起ARGs的蔓延和傳播.廢水處理系統中常見的A2O、氧化溝等工藝是為去除廢水中的常規污染物而設計, 對ARGs沒有良好的去除效果在情理之中.為減少經廢水處理系統排放至自然環境的ARGs的總量, 在保證常規污染物去除效率的基礎上, 強化ARGs的高效去除, 將是未來廢水處理技術發展需要應對的挑戰.
3 結論
(1) 在浙江省某精細化工園區的兩座廢水處理系統進水中, 分別檢出了10種和15種ARGs, 其中高頻率檢出的是四環素類和磺胺類ARGs; 磺胺類ARGs的絕對豐度最高, 為105~106 copies ·mL-1, 隨后濃度由高到低依次為dfrA 13 、tetQ、floR、tetO和tetW基因; 首次檢出dfrA 13 抗性基因, 且其絕對豐度高于四環素類ARGs.
(2) 兩座廢水處理系統的水樣中16S rRNA濃度低于市政污水處理系統的濃度水平, 并與7種ARGs的總濃度、sul Ⅰ 、sul Ⅱ 基因濃度顯著正相關.
(3) 制藥廢水處理系統出水僅占園區綜合性廢水處理系統總水量的0.87%, 而總ARGs的貢獻率為5.05%, 傳播輸出最高的3種ARGs為sul Ⅰ 、floR和tetW基因.
(4) 制藥廢水處理系統使廢水中總ARGs濃度上升0.21個數量級, 綜合性廢水處理系統使廢水中總ARGs濃度下降1.03個數量級; 最終出水直接排海, 可能對近海微生物群落產生影響, 應進一步評估ARGs通過廢水處理系統進入環境的濃度水平和健康效應.(來源：環境科學 作者：李奧林)
