氨氧化細(xì)菌( ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌( nitrite-oxidizing bacteria,NOB)統(tǒng)稱(chēng)為硝化細(xì)菌,是實(shí)現(xiàn)生物硝化過(guò)程的功能微生物。 首先由 AOB 將 NH +4 氧化為 NO -2 完成亞硝化,之后由 NOB 將 NO -2 氧化至 NO -3 ,完成全部硝化過(guò)程,第一步被稱(chēng)為短程硝化,較之于全程硝化可節(jié)約 25% 的氧氣消耗。 實(shí)際中因運(yùn)行條件所限,短程硝化難以維持,亞硝化反應(yīng)生成的 NO -2 很快被氧化為NO -3。目前我國(guó)污水處理廠(chǎng)普遍采用活性污泥工藝進(jìn)行生物脫氮,但普遍面臨硝化速率較低、低溫季節(jié)尤為嚴(yán)重的問(wèn)題。 因污水中硝化細(xì)菌濃度和硝化速率成正比,且硝化速率直接影響污水處理工藝的處理效果,為此,一些研究人員采用添加載體填料、細(xì)胞固定化生物活性填料或生物添加等方式增加反應(yīng)器內(nèi)硝化細(xì)菌濃度,以提高硝化反應(yīng)速率。

　　已有研究報(bào)道,研究人員采用選擇性培養(yǎng)基從污水處理反應(yīng)器中成功分離出具有較高硝化能力的硝化細(xì)菌菌株,試圖通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)以提高污水處理硝化速率;但是純種細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)脆弱,對(duì)實(shí)際污水的適應(yīng)能力較差,而復(fù)合菌群因具有生物多樣性而更具優(yōu)勢(shì)。本研究以篩選和富集硝化細(xì)菌菌群并且實(shí)現(xiàn)高氨氮氧化能力為目標(biāo),以此為基礎(chǔ),重點(diǎn)考察了 pH 值和硝化細(xì)菌濃度對(duì)氨氮氧化速率的影響,以期為實(shí)際中提升氨氮污廢水處理的氨氮氧化速率提供理論指導(dǎo)。

　　1　 材料與方法

　　1. 1　 實(shí)驗(yàn)裝置和原水

　　本研究采用一內(nèi)徑為 16 cm,高度為 50 cm 的細(xì)菌發(fā)酵罐( Labfors,INFORS 公司,瑞士)為實(shí)驗(yàn)裝置,有效容積為 6 L,上部為圓柱形,底部為半球狀。 采用穿孔管曝氣,氣體流量計(jì)調(diào)節(jié)曝氣量控制溶解氧(DO)濃度;溫度傳感器在線(xiàn)監(jiān)測(cè)反應(yīng)器內(nèi)水溫的變化,控制溫度(28 ± 1)℃;攪拌轉(zhuǎn)速 100 r·min - 1;由蠕動(dòng)泵自動(dòng)加堿(Na2CO3 和 NaHCO3 )調(diào)節(jié) pH、補(bǔ)充堿度并作為碳源;反應(yīng)器上方設(shè)置一取樣口,用于取樣、進(jìn)水、虹吸排水和測(cè)定溶解氧。

　　接種污泥取自北京高碑店污水處理廠(chǎng) A2/ O 工藝回流污泥。 原水采用人工配水,由高濃度基礎(chǔ)液和去離子水配制成預(yù)期濃度,其中 NH +4 -N(NH4Cl)濃度隨反應(yīng)速率升高而逐漸提高,其他水質(zhì)指標(biāo)平均值約為:PO3 -4 -P(KH2 PO4 和 K2HPO4·3H2O) 20 mg·L - 1,MgSO4·7H2O 30 mg·L - 1,CaCl2 15 mg·L - 1,FeSO4·7H2O 30 mg·L - 1,NaCl 20 mg·L - 1,微量元素 1 mL·L - 1。 成分:ZnSO4·7H2O 0. 5 g·L - 1,MnCl2·4H2O 0. 5 g·L - 1,CoCl2·6H2O 0. 4 g·L - 1,CuSO4·5H2O 0. 4 g·L - 1,NiCl2·6H2O 0. 2 g·L - 1,Na2MoO4·2H2O 0. 05 g·L - 1,EDTA 1 g·L - 1。

　　1. 2　 實(shí)驗(yàn)方法

　　采用間歇方式運(yùn)行,每天運(yùn)行 2 周期,每周期分為進(jìn)水、反應(yīng)、污泥沉淀、排水 4 階段。 好氧反應(yīng) DO初始范圍 1. 2 ~ 2. 5 mg·L - 1,pH 值范圍 6. 8 ~ 7. 7。 運(yùn)行近 1 個(gè)月以篩選和富集硝化細(xì)菌菌群。

　　此外,考察 pH 值對(duì)氨氮氧化速率的影響。 有效容積 6 L,盡管在硝化細(xì)菌篩選和富集培養(yǎng)期間,NOB活性受到一定程度抑制,表現(xiàn)為較低初始游離氨( FA)濃度下,間歇式反應(yīng) NH +4 -N 氧化過(guò)程中產(chǎn)生亞硝酸鹽積累;但以此為相同背景,反應(yīng)全程 pH 值分別為 6. 5 ± 0. 1、7. 0 ± 0. 1、7. 5 ± 0. 1 和 8. 0 ± 0. 1,由自動(dòng)加堿裝置調(diào)節(jié) pH 以保持初始水平,采用間歇運(yùn)行方式,各組實(shí)驗(yàn)初始 NH +4 -N 濃度和 DO 水平均分別控制在65 mg·L - 1和 2. 5 mg·L - 1左右。 間歇運(yùn)行時(shí)間以保證 NH +4 -N 盡可能氧化完全為宜。 因 NH +4 -N 氧化接近結(jié)束時(shí) DO 升高導(dǎo)致菌體自身氧化分解,因此系統(tǒng)污泥濃度(MLSS)有所減少。

　　在此基礎(chǔ)上,考察細(xì)菌濃度對(duì)氨氮氧化速率的影響。 通過(guò)沉淀排水保留污泥,之后進(jìn)水至 3 L,相當(dāng)于反應(yīng)有效容積縮小 50% ,污泥濃度(硝化細(xì)菌濃度)提高 1 倍,反應(yīng)全程 pH 值為 7. 3 ± 0. 1,初始 NH +4 -N濃度和 DO 水平同 pH 影響實(shí)驗(yàn)。

　　1. 3　 測(cè)定方法

　　進(jìn)行化學(xué)分析前,樣品先采用中速定性濾紙過(guò)濾。 分析項(xiàng)目 NH +4 -N、NO -2 -N、NO -3 -N 濃度和 MLSS 按照國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。 DO 濃度采用 WTW Oxi315i 溶解氧儀進(jìn)行測(cè)定。 游離氨( free ammonia,FA)濃度按式(1)計(jì)算：

　　式中:FA 為游離氨濃度,mg·L - 1;[NH +4 -N]表示 NH +4 -N 濃度,mg·L - 1;T 為溫度,℃。

　　以一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)開(kāi)始和結(jié)束時(shí) NH +4 -N 濃度減少量計(jì)算氨氮氧化速率,按式(2)計(jì)算:

　　式中:AOR 為氨氮氧化速率,mg·( L·h) - 1;[NH +4 -N]表示 NH +4 -N 濃度,mg·L - 1;t 表示反應(yīng)時(shí)間,h。

　　由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每周期換水后系統(tǒng)剩余少量 NO -2 -N、NO -3 -N,因此以每周期反應(yīng)開(kāi)始和結(jié)束時(shí) NO -2 -N 和 NO -3 -N 濃度計(jì)算生成量,以評(píng)價(jià)亞硝酸鹽積累率,按式(3)計(jì)算:

　　式中:[NO -2 -N] 開(kāi)始為反應(yīng)初始 NO -2 -N 濃度,mg·L - 1;[ NO -2 -N] 結(jié)束為反應(yīng)結(jié)束 NO -2 -N 濃度,mg·L - 1;[NO -3 -N] 開(kāi)始為反應(yīng)初始 NO -3 -N 濃度,mg·L - 1;[NO -3 -N] 結(jié)束為反應(yīng)結(jié)束 NO -3 -N 濃度,mg·L - 1。

　　注:若生成量為負(fù)值,則按零計(jì)算。

　　1. 4　 熒光原位雜交(FISH)分析

　　采用熒光原位雜交( fluorescence in situ hybridization,FISH)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)后的活性污泥中 AOB、NOB和總細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè),以考察硝化細(xì)菌菌群篩選和富集效果,所用探針序列見(jiàn)表 1。 并采用 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡對(duì)雜交后的每個(gè)污泥樣品隨機(jī)拍攝 10 ~ 20 張照片,之后用 Image-Pro Plus 6. 0 軟件對(duì)種群數(shù)量進(jìn)行分析。

　　注:1) EUBmix 由 EUB338、EUB338II 和 EUB338Ⅲ按摩爾濃度比1 ∶ 1 ∶ 1 混合組成,其甲酰胺濃度( FA)不受限制,可遵循另一種目標(biāo)探針的甲酰胺濃度,本研究遵循 NIT3 為 40% 。

表 1　 FISH 分析中采用的探針序列、目標(biāo)細(xì)菌和熒光標(biāo)記

　　2　 結(jié)果與討論

　　2. 1　 硝化細(xì)菌菌群篩選和富集效果

　　為快速實(shí)現(xiàn)硝化細(xì)菌菌群的篩選和富集,本研究溫度設(shè)定為 28 ℃ 左右利于硝化細(xì)菌生長(zhǎng)。 實(shí)驗(yàn)第 1 天采用間歇運(yùn)行方式考察接種污泥的氨氮氧化速率約 15 mg·( L·h) - 1,為全程硝化污泥,接種污泥濃度 3 784 mg·L - 1。 培養(yǎng)近 1 個(gè)月時(shí),采用間歇式運(yùn)行,pH 為 7. 3 ± 0. 1,第 1 小時(shí)氨氮氧化速率達(dá)到 47. 21 mg·( L·h) - 1,是接種污泥的 3 倍多,如圖1 所示。 然而污泥濃度相對(duì)于啟動(dòng)初期明顯降低。由此可以反映出,在此期間硝化細(xì)菌在適宜的運(yùn)行條件下得以大量生長(zhǎng),且活性污泥中其他細(xì)菌逐漸被淘洗出反應(yīng)器,從而硝化細(xì)菌的濃度升高,成為優(yōu)勢(shì)菌群。

　　2. 2　 pH 值對(duì)氨氮氧化速率、亞硝酸鹽積累和硝酸鹽生成的影響

　　在硝化細(xì)菌篩選和富集期間,發(fā)現(xiàn) pH 波動(dòng)對(duì)氨氮氧化速率產(chǎn)生明顯影響,為此重點(diǎn)考察 pH 值對(duì)氨氮氧化速率的影響,初始 DO 濃度均控制為 2. 5 mg·L - 1左右以排除低溶解氧導(dǎo)致亞硝酸鹽積累。 結(jié)果如圖 2 所示,pH 分別為 6. 5 ± 0. 1、7. 0 ± 0. 1、7. 5 ± 0. 1 和 8. 0 ± 0. 1 時(shí),NH +4 -N 由 65 mg·L - 1左右至基本反應(yīng)完全,時(shí)間分別為 5 h、3 h、2 h 和 100 min,反應(yīng)結(jié)束時(shí),亞硝酸鹽積累率分別為 0、0、23. 65%和 55. 29% 。

　　通過(guò)觀(guān)察各 pH 值下氨氮氧化時(shí)間和亞硝酸鹽積累的變化,分析 pH 對(duì)氨氮氧化速率和亞硝酸鹽積累影響的原因,主要包括以下 2 個(gè)方面: 1) pH 影響硝化細(xì)菌的生長(zhǎng);2) pH 影響 FA 水平,進(jìn)而影響 NOB的活性。 研究表明,微生物的生長(zhǎng)繁殖與所處環(huán)境的 pH 值密切相關(guān),不同微生物生長(zhǎng)所需的最佳 pH 范圍有所差異,普遍認(rèn)為,適宜 AOB 生長(zhǎng)的 pH 范圍為 7. 0 ~ 8. 5,NOB 為 6. 0 ~ 7. 5;因此,pH 處于 6. 5 的低水平下,對(duì) AOB 的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響,氨氮氧化速率明顯減慢,進(jìn)而影響硝化第 2 步反應(yīng)速率,導(dǎo)致整個(gè)硝化過(guò)程反應(yīng)速率較慢。 而 pH 處于8. 0 的高水平下,利于 AOB 生長(zhǎng),氨氮氧化速率加快。 由此可以說(shuō)明在適當(dāng)范圍內(nèi),pH 值升高利于提高氨氮氧化速率。

　　此外,游離氨( FA)對(duì)硝化細(xì)菌的活性產(chǎn)生抑制作用,且 AOB 比 NOB 承受 FA 的抑制能力更強(qiáng),其抑制作用的閾值一般在 10 ~ 150 mg·L - 1和 0. 1 ~ 1. 0 mg·L - 1。 根據(jù)公式(1) ,提高 pH 值,FA 水平隨之提高,達(dá)到對(duì) NOB 產(chǎn)生抑制作用的閾值范圍,即產(chǎn)生亞硝酸鹽積累,且 NOB 抑制程度與 FA 水平呈正相關(guān)。 以本實(shí)驗(yàn) NH +4 -N 濃度65 mg·L - 1、溫度28 ℃、pH 分別為 6. 5、7. 0、7. 5 和8. 0 計(jì),采用公式(1)計(jì)算得 FA 濃度,結(jié)果如表 2 所示。

 表 2　 不同 pH 下的游離氨(FA)濃度

　　在圖 2( a)中,pH 值為 6. 5 時(shí),初始 FA 濃度為0. 17 mg·L - 1,相對(duì)于 NOB 的抑制作用閾值 0. 1 ~1. 0 mg·L - 1處于較低水平,基本未對(duì) NOB 產(chǎn)生抑制,硝化反應(yīng)第 1 步生成的 NO -2 -N 幾乎同步轉(zhuǎn)化為NO -3 -N,反應(yīng)過(guò)程中幾乎無(wú) NO -2 -N 積累,NO -2 -N 曲線(xiàn)基本呈水平狀態(tài),屬于全程硝化。

　　在圖 2( b)中,pH 值為 7. 0 時(shí),初始 FA 濃度為0. 55 mg·L - 1,對(duì) NOB 產(chǎn)生一定程度的抑制。 反應(yīng)開(kāi)始前 60 min,FA 抑制作用明顯,NO -2 -N 濃度逐漸上升,但 NO -3 -N 濃度高于 NO -2 -N 濃度,第 60 分鐘時(shí),NO -2 -N 積累量達(dá)到最高值 15. 20 mg·L - 1。 此后著反應(yīng)的進(jìn)行,NH +4 -N 濃度降低,FA 隨之降低,對(duì) NOB 的抑制作用逐漸減弱,氨氮完全氧化時(shí),NO -2 -N部氧化為 NO -3 -N,整個(gè)反應(yīng)過(guò)程仍屬于全程硝化。

　　在圖 2( c)和( d)中,pH 值 7. 5 和 8. 0 時(shí),初始 FA 濃度分別達(dá)到 1. 72 mg·L - 1和 5. 18 mg·L - 1,NOB 抑制作用較強(qiáng),NO -2 -N 峰值在 90 min 和 75 min 時(shí)分別達(dá)到 31. 16 mg·L - 1和 39. 11 mg·L - 1,pH高,NO -2 -N 峰值越大,表明 FA 對(duì) NOB 的抑制作用越強(qiáng)。 反應(yīng)結(jié)束時(shí),NO -3 -N 和 NO -2 -N 共存,亞硝酸鹽累率分別達(dá)到 23. 65%和 55. 29% 。 由此表明反應(yīng)過(guò)程中 FA 抑制了 NOB 的活性,導(dǎo)致了 NO -2 -N 積累。

　　綜上所述,4 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì),隨著反應(yīng)的進(jìn)行,NH +4 -N 濃度逐漸降低、NO -2 -N度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),NO -3 -N 濃度一直升高。 結(jié)果表明在一定氨氮底物濃度和溫度條件下,pH越高,FA 濃度越大,對(duì) NOB 的抑制作用越強(qiáng),反應(yīng)結(jié)束時(shí)亞硝酸鹽積累率越高。 這與 CIUDAD 等、王瑩等的研究結(jié)果相符。

　　2. 3　 硝化細(xì)菌濃度對(duì)氨氮氧化速率的影響

　　采用提高污泥濃度的方式進(jìn)一步提高反應(yīng)器內(nèi)硝化細(xì)菌濃度,初始 DO 濃度均控制為 2. 5 mg·L - 1左右以排除低溶解氧導(dǎo)致氨氮氧化速率降低。 結(jié)果如圖 3 所示,污泥濃度提高 1 倍,氨氮氧化速率顯著提高,氨氮氧化完成的時(shí)間由150 min 縮短至105 min,反應(yīng)時(shí)間縮短45 min,用時(shí)為6 L 的70% ,第1 小時(shí)的氨氮氧化速率由 36. 52 mg·( L·h) - 1提高至 56. 93 mg·( L·h) - 1。 由此表明硝化細(xì)菌濃度提高,反應(yīng)速率加快,氨氮氧化完成時(shí)間提前。 而鄭敏等通過(guò)小試實(shí)驗(yàn)同樣得出,通過(guò)向反應(yīng)器內(nèi)投加包埋硝化細(xì)菌填料和附著生物膜填料,以人工強(qiáng)化方式增加硝化細(xì)菌數(shù)量,氨氮去除效果均優(yōu)于未投加填料的活性污泥系統(tǒng),并且采用提高 MLVSS 的方式可以強(qiáng)化氨氮氧化速率的結(jié)論。

　　此外,如圖 3 所示,有效容積 6 L 時(shí),NO -2 -N 峰值出現(xiàn)較晚,90 min 時(shí)才出現(xiàn)最高值 27. 58 mg·L - 1;而 3 L 時(shí),NO -2 -N 峰值出現(xiàn)時(shí)間較早,45 min 時(shí)即達(dá)到 25. 68 mg·L - 1。 表明提高硝化細(xì)菌濃度,NO -2 -N氧化為 NO -3 -N 的速率加快,因此氨氮氧化完成時(shí)基本無(wú) NO -2 -N 積累。

　　2. 4　 FISH 分析

　　采用 FISH 技術(shù)分析篩選和富集培養(yǎng)后活性污泥中 AOB 和 NOB 在總細(xì)菌中的數(shù)量比例結(jié)果如圖4 所示。 根據(jù)面積比例計(jì)算平均值,統(tǒng)計(jì)獲得 AOB 和 NOB 分別約占細(xì)菌總數(shù)的 35% 和 42% ( Ni-trobacter:40% ,Nitrospira:2% ) ,表明系統(tǒng)以適宜硝化細(xì)菌生長(zhǎng)的參數(shù)運(yùn)行,可以實(shí)現(xiàn)硝化細(xì)菌菌群的篩選和富集,獲得以 AOB 和 NOB 占有絕對(duì)數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)的高純度硝化細(xì)菌菌群,從而實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)內(nèi)活性污泥的種群優(yōu)化。具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.jianfeilema.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3　 結(jié)論

　　1)采用適宜 AOB 和 NOB 共同生長(zhǎng)的反應(yīng)條件可以成功篩選和富集高純度硝化細(xì)菌菌群,保留接種污泥中硝化細(xì)菌的菌群組成,同時(shí)實(shí)現(xiàn)高氨氮氧化速率。

　　2)在一定氨氮底物濃度和溫度條件下,提高 pH 值則 FA 升高,利于實(shí)現(xiàn)短程硝化,亞硝酸鹽積累率與FA 水平呈正相關(guān),此外在適當(dāng)范圍內(nèi)提高 pH 值有助于提高氨氮氧化速率。

　　3)反應(yīng)體系內(nèi)較高的硝化細(xì)菌濃度是實(shí)現(xiàn)高氨氮氧化速率的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。