隨著水體富營養化問題日益突出，氮素污染的防治越來越受到人們的重視。目前污水脫氮處理方法主要有化學法、生化法及生物物理-物化組合工藝。其中生物脫氮以其經濟、高效、無殘留污染的優點，成為污水脫氮的主要手段。但是，傳統的生物脫氮分硝化和反硝化等不同過程，要求在2個反應器中進行，故建設成本高，而且反硝化部分還需要投加大量碳源。
近年來，隨著具有異養硝化-好氧反硝化特性菌株的發現，利用異養硝化-好氧反硝化菌研發污水脫氮技術已成為研究熱點。與傳統硝化微生物相比，異養硝化-好氧反硝化菌具有更高的細胞生長速率，并且實現了在同一個反應器中同步完成硝化和反硝化反應，同時將氨氮、硝態氮和亞硝態氮轉化為含氮氣體。而且，在硝化和反硝化過程中分別產生的酸和堿能相互中和，從而相對維持水體酸堿平衡，減少pH調節成本。此外，一些特殊異養硝化-好氧反硝化菌甚至還具備耐受高氨氮、高鹽度、低溫和低C/N的特性。目前已發現的異養硝化-好氧反硝化菌主要有產堿菌屬(Alcaligenes)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)等。然而，由于異養硝化-好氧反硝化菌在養殖廢水中存在脫氮效果穩定性差、環境適應力和競爭力弱等問題，故實際應用于畜禽養殖廢水的異養硝化-好氧反硝化菌較少。為此，本研究從南昌縣一中型養豬廠曝氣池篩選出一株脫氮性能較好的異養硝化-好氧反硝化菌株YZ-12，經過16SrRNA基因序列分析鑒定菌株種屬，分析了優化菌株脫氮條件，并將該菌株應用于養豬廢水脫氮實驗，以期為豬場養殖廢水提供脫氮效果優良、環境適應力和競爭力強的微生物菌劑。
1、材料與方法
1.1 實驗材料
篩選樣品采自南昌縣一中型養豬廠曝氣池；細菌DNA提取試劑盒購自美國OmegaBio-Tek公司，PCR聚合酶購自TOYOBO公司，27F/1492R引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為國產分析純。
1.2 培養基
富集培養基的成分為：1g胰蛋白胨，0.5g酵母膏，0.1gKNO3，1L蒸餾水，pH為7.2。BTB初篩培養基：8.5gC4H4Na2O4∙6H2O，1gKNO3，1gMgSO4∙7H2O，1gKH2PO4，0.05gFeSO4∙7H2O，0.2gCaCl2∙2H2O，20g瓊脂，1mL1%溴百里酚藍，1L蒸餾水，pH為7.0~7.3。硝化培養基的成分為：11gC4H4Na2O4∙6H2O，6.7gNa2HPO4∙12H2O，1.5gNH4Cl，1gKH2PO4，0.1gMgSO4∙7H2O，2mL微量元素溶液，1L蒸餾水，pH為7.0~7.3。反硝化培養基的成分為：13gC4H4Na2O4∙6H2O，7.9gNa2HPO4∙12H2O，3gKNO3，1.5gKH2PO4，0.1gMgSO4∙7H2O，2mL微量元素溶液，1L蒸餾水，pH為7.0~7.3。微量元素溶液的成分為：50gEDTA，7.28gCaCl2∙2H2O，5gFeSO4∙7H2O，3.92gZnSO4∙7H2O，2.06gMnCl2∙4H2O，1.61gCoCl2∙6H2O，1.57gCuSO4∙5H2O，1.1g(NH4)6Mo7O24∙4H2O，1L蒸餾水，pH為6.0。
1.3 異養硝化-好氧反硝化菌的篩選及鑒定
取10mL養殖廢水，加入到裝有90mL無菌富集培養基的250mL三角瓶中，30℃、120r∙min-1恒溫培養24h，取5mL培養液轉接，重復富集3次。將富集液進行梯度稀釋(10-4~10-7)，取0.2mL涂布于BTB初篩培養基上，在30℃培養箱中培養至出現明顯的單菌落。挑取變藍單菌落，經多次劃線純化后于4℃冰箱中保存。
將保存的菌株分別接種于無菌富集培養基中，在30℃、120r∙min-1下恒溫培養24h，按3%接種量分別加到硝化培養基和反硝化培養基中，在30℃、120r∙min-1下恒溫培養48h，取培養液檢測NH4+-N、NO3--N、NO2--N濃度，從而篩選出具有較好脫氮性能的異養硝化-好氧反硝化菌。
采用細菌DNA提取試劑盒提取菌株基因組的樣品，利用27F/1492R引物對樣品DNA進行擴增，用Sanger法對PCR產物進行測序，采用雙向引物測序，測序結果采用DNAMAN軟件進行拼接處理。
1.4 菌株的脫氮性能研究
1)菌株生長曲線的測定。菌株于富集培養基中活化后，按3%接種量分別接種于硝化培養基和反硝化培養基中，在30℃、120r∙min-1下恒溫培養54h，每3h檢測培養液OD600值，每6h檢測NH4+-N、NO3--N、NO2--N的質量濃度。
2)菌株的脫氮條件優化實驗�？疾炝颂荚�、氮濃度、C/N、pH、鹽度5種單因素對菌株脫氮效果的影響。其中，碳源分別為葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、甲醇和丁二酸鈉；NH4+-N質量濃度分別為50、100、150、200和250mg·L-1；NO3--N質量濃度分別為400、450、500、550和600mg·L-1；C/N分別為2.5、5、10、15和20；pH分別為5、6、7、8和9；鹽度分別為10、20、30、40和50g·L-1。30℃、120r∙min-1恒溫培養72h，每24h取樣檢測培養液OD600值及NH4+-N、NO3--N、NO2--N質量濃度。
1.5 菌株在養殖廢水中的應用
供試樣品為曝氣池的水泡糞污水，采集自南昌縣一中型養豬廠污水處理站好氧池。經檢測，養殖廢水樣品中COD為2031mg·L-1，NH4+-N質量濃度為362mg·L-1，NO3--N質量濃度為23.8mg·L-1，pH為7.8。
用蔗糖將養殖廢水C/N調節為10，并進行以下3種處理：1)121℃滅菌30min，按5%接種量接入菌株YZ-12懸液；2)不滅菌，按5%接種量接入菌株YZ-12懸液；3)不滅菌，按5%接種量接入無菌水。在30℃，120r∙min-1恒溫培養48h，每24h取樣檢測NH4+-N、NO3--N、NO2--N質量濃度，每個處理3個重復。
1.6 分析方法
NH4+-N使用納氏試劑分光光度法測定；NO3--N、NO2--N使用離子色譜法測定；OD600使用光電比濁法測定；COD使用重鉻酸鹽法測定；pH使用上海雷磁PHSJ-3FpH計測定。
2、結果與討論
2.1 異養硝化-好氧反硝化菌的篩選及鑒定
從養殖廢水中共篩選出15株細菌，脫氮效果如圖1所示。其中12號菌株(YZ-12)對氨氮去除率為60.52%，對硝態氮去除率為93.39%，其脫氮效果最佳，故將其用于后續的脫氮實驗。
提取菌株YZ-12的DNA，使用細菌16S通用引物進行擴增測序，將測序結果得到的seq文件中的序列信息，輸入NCBI數據中的Blast比對系統中，搜索數據庫中相似的序列，得到序列比對結果。菌株YZ-12與Klebsiellaoxytoca strain相似度最高，同源性為100%，采用Mega7.0軟件構建菌株系統發育樹(圖2)。
2.2 菌株YZ-12的脫氮性能研究
1)菌株YZ-12生長曲線的測定。由圖3可以看出，菌株YZ-12的對數生長期為12~30h，穩定期為30~48h，48h后進入衰亡期。在對數生長期，氨氮被快速去除，NH4+-N由326mg·L-1下降至156mg·L-1，氨氮去除率為52.15%。在此脫氨過程中，硝態氮有少量產生后又去除，亞硝態氮幾乎未檢出，這與AN等、陳猛等的研究結果類似。由于初始氨氮質量濃度較高，與鄒艷艷等的研究結果相比，氨氮去除率下降明顯，但氨氮去除量明顯增加。在0~24h，NO3--N由415mg·L-1下降至0.215mg·L-1，硝態氮去除率為99.95%，同時NO2--N不斷積累，最高達到356mg·L-1。這與楊靜丹等的研究結果類似，碳源和碳氮比可能對NO2--N積累均有影響。
2)碳源對菌株YZ-12脫氮效果的影響。異養硝化-好氧反硝化是氧化還原反應，不同的碳源具有不同的氧化還原電位，所以會產生不同的脫氮效果。由圖4可以看出，以葡萄糖、蔗糖、丁二酸鈉為碳源進行異養硝化時，菌株均能正常生長，OD600值達到1.9以上，氨氮去除率最大分別為30%、42.86%、42.57%。此時，菌株無法利用甲醇為碳源，幾乎不生長，以乙酸鈉為碳源進行異養硝化時，菌株生長也受到抑制。因此，與甲醇、乙酸鈉、葡萄糖等碳源相比，蔗糖、丁二酸鈉作為異養硝化的碳源更具優勢。
由圖5可知，以葡萄糖、蔗糖、丁二酸鈉、乙酸鈉為碳源進行好氧反硝化時，菌株能正常生長，72h時NO3--N去除率均達到99%。其中，以葡萄糖、蔗糖為碳源時，24h時NO3--N去除率達到99%。但以葡萄糖、丁二酸鈉、乙酸鈉為碳源時，NO2--N有明顯累積，而以蔗糖為碳源時NO2--N幾乎未檢出。綜合選擇，蔗糖作為好氧反硝化碳源更具優勢。這與LIU等的研究結果一致。
3)初始氨氮質量濃度對菌株YZ-12脫氮效果的影響。不同廢水含氮量不同，配置不同初始氮濃度培養液，研究菌株的脫氮效果。由圖6可以看出，菌株YZ-12的異養硝化主要在24~48h，這是菌株生長期和穩定期，這24h內平均NH4+-N去除速率分別為1.10、2.86、3.90、4.06、4.17mg·(L·h)-1。當初始氨氮質量濃度為150~250mg·L-1時，其NH4+-N去除速率趨于穩定；當初始氨氮質量濃度為50mg·L-1時，菌株YZ-12因為氮源不足，影響菌的生長，從而影響了NH4+-N去除速率。高游離氨濃度廢水對異養硝化-好氧反硝化菌具有毒性，當NH4+-N為150、200、250mg·L-1時，其氨氮去除率分別為86.64%、67.02%、53.81%，與NH4+-N為100mg·L-1時96.81%的去除率相比，差異顯著。
硝態氮質量濃度對YZ-12好氧反硝化的影響如圖7所示。菌株YZ-12的好氧反硝化主要發生在0~48h，當初始硝態氮質量濃度為400~450mg·L-1時，在0~24h的NO3--N去除速率分別為16.56、16.43mg·(L·h)-1；當初始硝態氮質量濃度升高至500~600mg·L-1時，在0~24h的NO3--N去除速率分別下降至8.96、6.50、4.71mg·(L·h)-1，同時還有部分亞硝態氮積累。這可能因高濃度硝態氮對菌株的好氧反硝化作用起到了抑制作用。
4)碳氮比對菌株YZ-12脫氮效果的影響。不同碳氮比對菌株YZ-12脫氮的影響如圖8和圖9所示。在C/N為2.5和5的硝化培養液中，菌株生長緩慢，NH4+-N去除率不高，分別為40.00%和62.84%。這是因為低C/N影響微生物酶活性，從而影響脫氮率及菌株的生長。當C/N為10、15、20時，NH4+-N均在48h后降至10mg·L-1以下，菌株生長良好。所以，菌株YZ-12異養硝化最佳C/N為10~20。
對于菌株好氧反硝化而言，當C/N在2.5~20時，菌株均能良好生長，且C/N越高，菌株生長越好。當C/N為5~20時，培養24h后其NO3--N去除率為99.6%。在C/N=10時，NO2--N有明顯累積，后又去除；但當C/N=5時，NO3--N均轉化為NO2-N；當C/N=2.5時，NO3--N也慢慢轉化為NO2--N，未能去除。綜合考慮，菌株YZ-12最佳好養反硝化C/N為10~20。這符合大多數異養硝化-好氧反硝化菌最佳C/N范圍(6~20)。
5)pH對菌株YZ-12脫氮效果的影響。不同pH對菌株YZ-12脫氮的影響如圖10和圖11所示。在pH為5~9的硝化培養液中，菌株均能正常生長。菌株在pH為7、8、9的培養液中培養48h，NH4+-N去除率均為98%以上。但在酸性條件下NH4+-N去除率有所下降，在pH為5和6時，NH4+-N最大去除率分別為62.00%和78.53%。這說明菌株YZ-12更適合處理中性及偏堿性廢水，這與胡杰等獲得的結果相近。
酸性環境不僅影響菌株YZ-12降解硝態氮效果，同時還會影響菌株生長。菌株在pH為7、8、9的培養液中培養24h，NO3--N的去除率均在99%以上，且生長良好；但pH為7時，則有62.7mg·L-1的NO2--N積累。有研究表明，反硝化酶在中性或微堿性環境中活性更高，在偏酸性條件下其活性受到抑制，導致脫氮效果下降，這與本研究結果一致。
6)鹽度對菌株YZ-12脫氮效果的影響。部分異養硝化-好氧反硝化菌具有耐鹽性。由圖12可以看出，鹽度對硝化作用影響顯著，在鹽度為10g·L-1和20g·L-1的異養硝化培養基中，菌株YZ-12能夠正常生長，NH4+-N去除率最大分別為99.02%和66.70%；當鹽度為30g·L-1時，菌株在48h適應高鹽環境后開始生長，NH4+-N在72h時去除率為23%。這說明菌株具有一定的耐鹽性。當鹽度≥40g·L-1時，高鹽環境會破壞細菌細胞，抑制細菌生長及代謝過程，導致菌株無法大量繁殖。
鹽度對YZ-12好氧反硝化的影響如圖13所示。當鹽度≥40g·L-1時，菌株也無法在反硝化培養基中生長；鹽度≤30g·L-1時，菌株具有良好的反硝化能力，培養48h后，NO3--N去除率均達到99%，同時僅有部分亞硝態氮積累。這說明菌株YZ-12屬于耐鹽菌，具有處理高鹽硝態氮廢水的能力。
2.3 菌株YZ-12在養殖廢水中的脫氮效果
由圖14可以看出，不同的處理方式下脫氮效果亦不同。不加菌液的養殖廢水中的微生物在合適的C/N條件下，NH4+-N和NO3--N的去除率分別為71.82%和55.46%。這說明養殖廢水中本身存在脫氮菌，在適宜生長條件下可以起到部分脫氮作用。不滅菌加5%菌液處理的養殖廢水NH4+-N和NO3--N的去除率分別為88.54%和96.0%。這說明加入5%的YZ-12菌液后，YZ-12在養殖廢水中競爭力強，能夠提升脫氮效果，但受到其他菌種的影響。滅菌加5%菌液處理的養殖廢水NH4+-N和NO3--N的去除率分別為95.15%和99.69%。該處理的NH4+-N去除率高于陳猛等實驗結果，與陳均利等的實驗結果相似，說明菌株YZ-12在不受其它菌株影響時，對養殖廢水具有更好的脫氮效果。
3、 結論
1)從養豬廠污水處理站曝氣池篩選出一株異養硝化-好氧反硝化菌株Klebsiellaoxytoca YZ-12，該菌株具有較好的異養硝化-好氧反硝化能力，同時還具有一定的耐鹽性，能夠獨立完成脫氮全部過程。
2)菌株YZ-12最適脫氮條件為C/N=10、pH=7、鹽度≤10g·L-1、NH4+-N質量濃度≤150mg·L-1、NO3--N質量濃度≤450mg·L-1、碳源為蔗糖。
3)調節養殖廢水C/N后加入5%YZ-12菌株對其進行脫氮處理，48h后NH4+-N去除率達95.15%，NO3--N去除率達99.69%。這說明該菌株脫氮性能好且在養殖廢水中具有較強的競爭力和適應力。（來源：江西中江環保集團股份有限公司，贛江新區高濃度有機廢水污染控制工程技術研究中心）
