1 引言(Introduction)

　　甲烷(CH4)是僅次于CO2的第2種重要的溫室氣體.如何減排溫室氣體CH4成為了全球關注的焦點.同時, 生物脫氮是當前廢水處理領域的研究熱點.污水處理廠中通常通過硝化和反硝化實現生物脫氮, 而目前城鎮污水普遍存在C/N比低的問題, 導致在反硝化過程中往往需要大量的外加碳源.而在污水處理廠的厭氧處理過程中會產生大量的甲烷, 如能將這部分甲烷作為碳源進行利用, 既減少了甲烷的排放, 又節省了能源的消耗.反硝化型甲烷厭氧氧化反應(Denitrifying Anaerobic Methane Oxidation, DAMO)正是可以利用甲烷作為碳源完成反硝化脫氮的過程.DAMO過程是以甲烷為電子供體和唯一碳源, 以硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體的一種氧化還原反應.2006年, 該過程在實驗室中得以證實(Raghoebarsing et al., 2006).在自然界中, 溶解于水中的甲烷主要靠甲烷氧化菌等通過生物作用得以消耗;現已發現在淡水系統、濕地系統、近海海洋生態系統中(Deutzmann et al., 2011;Luesken et al., 2011;Kojima et al., 2012;Wang et al., 2012;Han et al., 2013;Shen et al., 2013;Shen et al., 2014)均有存在可以耦合甲烷厭氧氧化作用(Anaerobic Oxidation of Methane, AOM)和反硝化作用(Denitrification)的DAMO(Denitrifying Anaerobic Methane Oxidation, 反硝化型甲烷厭氧氧化)微生物.根據系統發育分析, 研究者檢測到的DAMO細菌隸屬于NC10門細菌;DAMO古菌則屬于甲烷厭氧氧化古菌ANME-2(Raghoebarsing et al., 2006).2017年, Wang等(2017)提出了側流式、主流式兩種DAMO反應應用于污水處理廠的設想.

　　目前污水處理廠進水多為低碳高氮性質, 多種化工、制藥廢水及垃圾滲濾液等, 都含有較高濃度的氨氮, 而高濃度的氨氮會對活性污泥中的微生物起抑制作用(鄭雄柳等, 2014), 并會影響系統微生物菌群結構.目前已有研究報道高濃度氨氮對活性污泥系統中硝化細菌、厭氧氨氧化細菌等微生物具有抑制作用(Zhou et al., 2011), 但對DAMO微生物的影響及機理鮮見報道.如欲將DAMO工藝應用于廢水生物脫氮, 探明氨氮對該過程的影響顯得尤為重要.因此, 本文利用已經成功富集的以DAMO細菌為優勢菌種的系統(以下簡稱DAMO細菌系統)(樓菊青等, 2016)為研究對象, 通過短期和長期試驗, 從宏觀和微觀兩個層面, 研究氨氮對DAMO過程脫氮性能、微生物菌群結構的影響, 綜合考察DAMO細菌對氨氮的應激性、耐受性, 并探索其抑制機理.為促進對DAMO微生物脫氮機理的研究和完善DAMO理論的發展添磚加瓦, 為該工藝向實際工程應用推進一步.

　　2 試驗材料與方法(Materials and methods)2.1 材料2.1.1 試驗系統

　　本文的試驗系統是基于之前已成功富集的以DAMO細菌為優勢菌種的混培物(樓菊青等, 2016).所得混培物是以淡水河道(西溪河)底泥、淡水湖泊(西湖)底泥及水稻農田土壤的混合物為接種污泥, 甲烷和亞硝酸鹽為唯一碳氮源.至本試驗止, 系統已穩定運行1392 d.

　　2.1.2 試驗裝置

　　試驗裝置為特制的直徑為7.5 cm、高度為17 cm的500 mL厭氧反應器.

　　2.2 試驗方法2.2.1 短期試驗方法

　　① 不同濃度氨氮對DAMO細菌的影響：通過批式實驗研究氨氮對以DAMO細菌為優勢菌種系統(以下簡稱DAMO細菌系統)的短期影響, 設3個平行試驗組和一個對照組, 試驗時長7 d, 氨氮濃度梯度分別為50、250、500、750、1000、1250、1500 mg·L-1.每12 h取3 mL水樣, 利用0.22 μm微孔濾膜過濾后進行三氮(氨氮NH4+-N、硝態氮NO3--N、亞硝態氮NO2--N)的測定.在最高氨氮梯度濃度試驗后, 取泥水混合液10 mL進行掃描電鏡分析實驗.②不同pH體系下氨氮的影響：根據上述短期試驗結果進行批式試驗, 選取750 mg·L-1氨氮作為試驗濃度.用0.1 mol·L-1 HCl或0.1 mol·L-1 NaOH分別將pH調節為6.5、6.8、7.0、7.5、7.8 5個濃度并利用pH計實時監控反應器內的pH值, 使其保持在相應的范圍內, 每組試驗持續7 d.取樣與測定同①.當T = 27 ℃時, 不同pH體系對應的FA濃度可由公式(1)計算得到.

　　式中, cFA為FA的濃度(mg·L-1);cNH4+為氨氮的濃度(mg·L-1);T為溫度(℃)

　　2.2.3 長期試驗方法

　　氨氮對DAMO細菌的長期影響試驗以短期試驗結果為依據, 將長期試驗分為連續的4個階段, 每個階段7 d, 這4個階段的氨氮濃度按照短期試驗濃度依次遞增(李媛, 2014), 濃度分別為500、750、1000、1250 mg·L-1, 在28 d后取樣進行高分子通量測序.

　　2.3 分析方法2.3.1 常規指標測定

　　NO3--N、NO2--N、NH4+-N測定方法參考《水和廢水監測分析方法》第四版(魏復盛, 2002).

　　2.3.2 微生物微觀形態結構分析

　　利用掃描電鏡對微生物微觀形態進行特性分析.在每個階段的短期試驗過程中, 取10 mL樣品, 在4000 r·min-1條件下離心5 min, 取上清液, 樣品處理后用掃描電子顯微鏡SEM(SU8010, Hitachi)進行微生物微觀形態的特性分析.

　　2.3.3 微生物群落結構分析

　　提取長期試驗前后污泥樣品中的基因組DNA, 儲于-20 ℃以下, 并利用高通量測序分析.利用上海申能博彩生物科技有限公司生產的3S柱離心式DNA抽提試劑盒進行樣品DNA的提取;利用特定PCR引物進行序列擴增, 全部樣本按照正式試驗條件均進行3次重復實驗;參照電泳初步定量結果, 將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量, 之后按照每個樣本的測序量要求, 進行相應比例的混合;通過構建Miseq文庫、Miseq測速對16S RNA序列進行測序;區分樣本后, 采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學分析, 與Silva數據庫比對, 并在門、綱、屬3個水平統計每個樣品的群落組成.

　　3 結果與討論(Results and discussion)3.1 氨氮對DAMO細菌的短期影響3.1.1 氨氮對以DAMO細菌脫氮性能的影響

　　不同濃度梯度(50~950 mg·L-1)的氨氮對DAMO細菌的脫氮性能影響見圖 1.其中圖 1a表示不同濃度氨氮作用下, 系統內亞硝酸氮的消耗曲線, 圖 1b表示不同濃度下亞硝酸氮的消耗速率與對照組的比值, 以v表示試驗組亞硝酸氮的消耗速率, v0表示對照組亞硝酸氮的消耗速率.其中誤差范圍由標準偏差表示.

　　圖 1

　　圖 1不同濃度NH4+-N對DAMO細菌脫氮性能的影響 (a.NO2--N消耗曲線, 以N計;b.試驗組與對照組的比值)

　　當控制pH實驗條件為7.0時, 通過公式(1)計算可知FA = 4.879 mg ·L-1, 由圖 1可見, 在一定范圍內, DAMO細菌脫氮性能隨著氨氮濃度的增加而降低.由圖 1a可知, 在空白對照組中, 其亞硝酸鹽初始濃度為30.19 mg·L-1, 7 d平均消耗速率為2.92 mg·L-1·d-1.在50、250 mg ·L-1氨氮作用下, 系統的亞硝酸氮的消耗速率分別為2.94 mg ·L-1·d-1和2.96 mg·L-1·d-1.相比于對照組, 消耗速率略有上升, 但經過單因素方差分析后可知, 其p值為0.65, 大于0.05, 說明3組數據無顯著性差異, 從而表明在50、250 mg·L-1氨氮作用下, 系統的脫氮性能并未出現抑制或促進現象(故該兩組數據未在圖 1a中表示).而當氨氮濃度增加至500 mg·L-1時, 7 d平均亞硝酸鹽消耗速率下降為2.42 mg·L-1·d-1, 其消耗速率為對照組的82.71%.當氨氮濃度為750 mg·L-1時, 7 d平均消耗速率與對照組相比, 下降了43.15%.當在1000 mg·L-1氨氮抑制條件下, 經7 d的消耗后, 消耗速率下降了56.20%.在1250 mg·L-1氨氮抑制條件下, 亞硝酸鹽7 d平均消耗速率僅為對照組的27.27%.Dapena-Mora等的研究認為針對厭氧氨氧化細菌, 氨氮的IC50為770 mg·L-1, 與本試驗結果相近(Dapena-Mora A, 2007), 可見, DAMO細菌對高氨氮廢水表現出較強的抗沖擊負荷的能力.這有利于DAMO細菌系統在含高氨氮廢水處理廠中的應用.

　　3.1.2 不同pH條件下氨氮對以DAMO細菌為優勢菌種系統的影響

　　根據3.1.1節的短期試驗結果, 選取750 mg·L-1的氨氮濃度進行試驗.當T=27 ℃, 不同pH體系下, 對應的FA的濃度可由公式(1)計算得到, 計算結果見表 1.

　　圖 2為不同pH時, DAMO細菌系統受氨氮影響時的脫氮性能.以pH = 7.0為對照組, 各pH條件下脫氮速率與該條件下脫氮速率比值為縱坐標, 得圖 2b, 由圖 2可知, 在堿性條件下(pH = 7.0、7.5、8.0), 同樣為750 mg·L-1的氨氮, 隨著pH升高, FA升高, 脫氮速率下降, 當pH=8.0時, 其FA濃度為46.09 mg·L-1, 此時脫氮速率不到對照組的1/2, 且對pH=7.0、7.5、8.0條件下所得3組數據進行單因素方差分析, 其p值為9.93×10-5, 遠小于0.01, 說明這3組數據之間有極顯著差異;而在酸性條件下(pH = 6.5、6.8、7.0), 雖然FA值隨著pH值的升高而升高, 但通過單因素方差分析發現脫氮速率與FA值并無顯著性差異.這說明在堿性條件下, 氨氮對系統的抑制效果與FA值有關, FA是限制性抑制因子, 該結果與氨氮對其他微生物抑制的大多數研究結果相吻合(Anthonisen, 1976);在酸性條件下, 抑制效果與FA的濃度無關, 認為離子化氨氮應是真正的抑制因子.該結果與之前部分研究相吻合, 當溶液呈酸性(pH < 7.0)時, 厭氧氨氧化菌、甲烷菌、反硝化菌等微生物活性受到抑制;甲烷菌(Lay, 1997)等的活性取決于離子化氨氮NH4+的濃度, 而不是質子化氨氮FA的濃度.

　　圖 2

　　圖 2不同pH下NH4+-N對DAMO細菌系統內NO2-消耗情況及脫氮性能的影響 (a.不同pH條件下NO2--N消耗曲線;b.不同pH條件下NH4+-N對系統脫氮性能的影響)

　　3.1.3 氨氮對DAMO細菌系統的微觀形態影響

　　在1500 mg·L-1的氨氮抑制試驗7 d后, 取污泥混合液10 mL離心后, 利用掃描電鏡分別觀察抑制前后的污泥結構與微生物微觀形態特性, 結果見圖 3.由圖 3可知, 氨氮抑制試驗之前, 在SEM下的絮狀污泥微觀結構清晰可見, 細菌形狀多樣, 以菌膠團的形式聚合在一起, 其中占主導地位的是球狀菌和短桿狀菌, 絲狀菌數量較少.菌的表面較為光滑, 附著有少量胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances, EPS).具體聯系污水寶或參見http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。

　　圖 3

　　圖 3氨氮抑制前后DAMO細菌系統掃描電鏡照片 (a.氨氮抑制前, b.氨氮抑制后)

　　經高濃度氨氮短期抑制后的污泥與抑制之前相比, 結構變得松散, 絲狀菌大量繁殖, 球狀菌和短桿狀菌則大量減少, 污泥出現了明顯的膨脹現象.而污泥中的微生物出現了明顯的皺縮現象, 另外微生物表面還包裹著一層粘性物質.由于聚合物覆蓋在微生物的表面, 在環境與微生物胞膜之間形成一個緩沖層, 這種緩沖層有助于保護細胞體免受有毒物質損害, 從生物反饋機制上理解：在環境條件改變的情況下, 微生物分泌大量EPS的行為可以歸結為生物應激性的一種表現, 從而能夠最大程度地避免微生物細胞體受危害.所以, 微生物表面包裹著的這層粘性物質應為細菌所分泌的EPS(鄭雄柳, 2014), 用以抵抗外界的不利因素.

　　3.2 氨氮對DAMO細菌的長期影響3.2.1 氨氮對以DAMO細菌脫氮性能的影響

　　氨氮對DAMO細菌系統長期抑制后對系統脫氮性能影響結果見圖 4.

　　圖 4

　　圖 4 DAMO細菌系統內NO2--N消耗曲線及長期抑制對脫氮性能的影響 (a.系統NO2--N消耗曲線;b.長期抑制對系統脫氮性能的影響)Fig. 4 NO2--N consumption and nitrogen removal performance in DAMO bacteria System under long term inhibition (a. NO2--N consumption curve; b. nitrogen removal performance in DAMO bacteria System)

　　控制第一階段(1~7 d)氨氮濃度維持在500 mg·L-1左右, 亞硝酸鹽初始實測濃度為29.95 mg·L-1, 7 d內平均消耗速率為2.37 mg·L-1·d-1, 與空白對照組相比其消耗速率下降了20.80%(圖 4b), 出現明顯抑制效應, 此時抑制效果與短期試驗基本沒有差別.控制第二階段(8~14 d)氨氮的濃度為750 mg·L-1左右, 亞硝酸鹽初始實測濃度為30.95 mg·L-1, 7 d平均消耗速率為1.14 mg·L-1·d-1, 與對照組相比其消耗速率下降62.02%, 而同樣為750 mg·L-1的短期試驗中, 其消耗速率只下降了43.15%.第三階段(15~21 d)氨氮的濃度控制在1000 mg·L-1左右, 該階段亞硝酸鹽初始濃度為31.91 mg·L-1, 7 d平均消耗速率為0.54 mg·L-1·d-1, 其消耗速率僅僅達到了對照組的18.04%(圖 4b), 而短期試驗該濃度下的NO2--N消耗速率卻還有對照組的43.80%, 可見, 與短期抑制相比, 在長期抑制條件下, 氨氮的毒性具有累積效應.

　　當氨氮的濃度上升到1250 mg·L-1時(22~28 d), 7 d內其亞硝酸氮的消耗速率僅為對照組的6.69%, 且經過單因素方差分析后發現, 與氨氮濃度為1000 mg·L-1條件下所得數據并無顯著性差異, 從而表明當控制氨氮濃度為1000 mg·L-1時, DAMO細菌系統的脫氮性能已基本被抑制.在長期抑制試驗的pH條件下(7.0), 氨氮濃度為500、750、1000 mg·L-1時, 其相對應的FA分別為3.253、4.879、6.505 mg·L-1, 其FA濃度依次升高, 而根據3.1.2節試驗結果可知, 在pH = 7.0~7.5條件下, 氨氮對系統的抑制效果與FA值相關, FA增加, 抑制效果增強.

　　3.2.2 氨氮對DAMO系統菌群結構的影響

　　本試驗利用第二代高通量測序技術Miseq高通量測序揭示氨氮抑制前后微生物群落多樣性的變化, 結果詳見表 2.其中, Coverage表示樣本文庫的覆蓋率, 其數值越高, 則樣本中序列被測出的概率就越高, 該指數反應測序結果是否代表了微生物的真實情況.在本試驗中, 所有Coverage指數均為99.85%, 故此次測序結果真實可靠.由表 2可知, 在經過4周高濃度氨氮抑制之后, OTUs的數值出現了明顯的下降, DAMO細菌系統初始的OTUs為288.00, 但抑制后僅為227.00, 此外, 表征群落豐度的指標Chao1值和Ace值也分別從320.00、328.98下降到255.27和255.64, 說明在抑制過程中系統內物種數不斷減少.而表征群落多樣性的指標, Shannon指數從3.11下降到2.26;Simpson指數從0.09上升到0.11, 說明抑制過程中系統內群落多樣性在不斷減少.綜上可知, 氨氮對以DAMO細菌為優勢菌種的微生物系統有明顯的抑制作用, 長期抑制后, 微生物系統的物種豐度以及多樣性明顯下降.

　　基于第二代高通量測序技術Miseq高通量測序, 對16S RNA序列進行測序.氨氮抑制前后DAMO細菌系統的微觀群落結構組成見圖 5.

　　圖 5

　　圖 5氨氮抑制前后DAMO細菌系統微觀群落結構 (a.氨氮抑制前;b.氨氮抑制后)

　　從圖 5可見, 氨氮對系統微生物群落結構有較大影響.

　　從門的層次上, 氨氮抑制實驗前后均檢測到28類已知門類的細菌, 其中氨氮抑制實驗前占優勢地位的是變形菌門(Proteobacteria, 35.13%)、綠菌門(Chlorobi, 30.25%)、浮霉菌門(Planctomycetes, 14.03%)和綠彎菌門(Chloroflexi, 12.54%).這幾類細菌都是厭氧脫氮生物反應器中常見的細菌(Guo, 2015; Shu, 2015).而在氨氮抑制實驗以后, 占據優勢地位的門類細菌種類不變, 但其比例已較抑制前發生較大改變, 變形菌門(Proteobacteria)從35.13%上升到67.23%, 綠菌門(Chlorobi)的比例從抑制前的30.25%下降到抑制后的16.94%, 而綠彎菌門(Chloroflexi)從12.54%下降到3.84%, 浮霉菌門(Planctomycetes)的比例從14.03%下降到1.08%.變形菌門在高濃度氨氮氮條件下比例升高, 說明高濃度氨氮對其有一定的促進作用;而對于綠菌門門、綠彎菌門及浮霉菌門, 抑制作用則十分顯著.

　　在綱的層次上進一步分析發現, 氨氮抑制實驗前, 變形菌門中Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Gammaproteobacteria均被檢測到, 其比例分比為：8.75%, 8.46%, 3.09%, 14.63%.但占比最大的是隸屬于綠菌門的Ignavibacteria(28.72%).系統中的優勢菌群為屬于綠菌門的Melioribacter, 屬于變形菌門的Methylomonas(甲基單胞菌屬), 及屬于浮霉菌門的SM1A02, 其比例分別為19.66%, 13.84%和13.07%.其次是屬于浮霉菌門的Phycisphaerae占比13.97%, 以及屬于綠彎菌門的Anaerolineae(厭氧蠅菌綱)占6.68%.綠彎菌門所屬細菌多為厭氧細菌.Melioribacter所屬的Ignavibacteria是綠菌門中唯一一類化能自養菌, 兼性厭氧(Podosokorskaya, 2013), 它與浮霉菌門的SM1A02都曾在厭氧氨氧化或其他具有反硝化功能的微生物系統中被檢測到(Chu, 2015).而在氨氮抑制實驗以后, 深入分析發現, 隸屬于綠菌門的Ignavibacteria其比例由抑制前的28.72%下降到10.44%, 這也是綠菌門比例下降的主要原因, 另外屬于綠菌門(Chlorobi)的綠硫細菌(Chlorobia)的比例從1.53%上升到6.51%.屬于綠彎菌門的Anaerolineae(厭氧蠅菌綱)也在氨氮的作用下由之前的6.68%下降到3.09%.屬于浮霉菌門的Phycisphaerae抑制前占比13.97%, 抑制后下降到0.99%.由此表明, 氨氮對Ignavibacteria、Anaerolineae以及Phycisphaerae有明顯的抑制作用.而在變形菌門中, 除Betaproteobacteria的比例從8.46%下降到6.58%外, Alphaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Gammaproteobacteria其比例分別從8.75%, 3.09%, 14.63%上升至18.71%, 5.20%, 35.70%, 這直接導致了在門的水平上, 變形菌門比例的顯著上升, 說明氨氮對變形菌門的促進作用主要集中在Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria以及Gammaproteobacteria.

　　通過對屬水平上群落結構的分析可發現, 優勢菌種在高濃度氨氮作用下發生了改變, 原本的優勢菌是屬于綠菌門的Melioribacter, 但其比例從抑制前的19.66%下降到7.58%, 說明該類菌對高氨氮的耐受性較差;屬于變形菌門的Methylomonas(甲基單胞菌屬), 其比例從13.84%下降到0.01%, 這種甲烷氧化細菌比例的下降, 應是系統脫氮性能下降的原因之一, Methylomonas(甲基單胞菌屬)在甲烷濃度較低的環境中具有一定的競爭力(Zeng, 2016), Kim等在該菌屬的細菌中檢測到了編碼甲烷單加氧酶(MMO)的基因而甲烷單加氧酶是甲烷氧化過程的第一步也是關鍵一步的催化劑(Kim, 2016), 同時在荷蘭的Lieshout污水處理廠底泥的DAMO分子檢測結果可知在系統發育樹中(Luesken, 2011)、實驗室內富集成功的DAMO微生物的Illumina序列分析結果中(Siniscalchi, 2017)等均有發現該菌屬的存在;屬于浮霉菌門的SM1A02, 其比例從13.07%下降到0.26%;同時出現了新的優勢菌種, 與Methylomonas(甲基單胞菌屬)同屬于變形菌門Gammaproteobacteria的Arenimonas其比例由0.01%上升到29.17%, 說明該類細菌在受長期高濃度氨氮影響的DAMO細菌系統中具有一定優勢, 亦對高濃度氨氮有較強的耐受能力.該類細菌多為桿狀菌, 革蘭氏陰性菌, 無芽孢, 無鞭毛, 不可移動, 但對于其在脫氮微生物系統中的作用尚不明朗.另外由于自然界中含有大量的不可培養或難以培養的微生物, 導致眾多菌群的生物學分類是未知的, 因而在序列信息比對過程中, 數據庫中鑒定到屬水平的菌種只是自然界的一部分, 大量的有效序列目前還無法找到合適的配對信息, 同時表明, 系統中囊括了未知菌屬, 需要進一步深入探究.

　　綜上可知, 在氨氮長期抑制作用下, DAMO細菌系統中物種豐度, 多樣性以及群落結構發生較大改變, 而Methylomonas(甲基單胞菌屬)的減少應是系統脫氮性能下降的主要原因.

　　4 結論(Conclusions)

　　1) 高濃度氨氮會影響DAMO微生物的生長和性能.在短期抑制條件下, 氨氮對DAMO細菌的安全濃度為250 mg·L-1;當氨氮濃度增至500 mg·L-1時, DAMO細菌的脫氮效率受到明顯抑制, 隨著濃度、時間的增加, 氨氮對其的抑制效果增強;當氨氮濃度增加到1500 mg·L-1時, 系統基本喪失脫氮性能.

　　2) 抑制前后的污泥結構與微生物微觀形態特性經過掃描電鏡分析發現, 高濃度氨氮短期抑制后, 污泥結構均變得松散, 絲狀菌大量繁殖, 球狀菌和短桿狀菌則大量減少, 污泥出現明顯的膨脹現象, 同時微生物分泌大量EPS, 以抵抗外界的不利環境.

　　3) 在不同pH體系下, 起到真正抑制作用的抑制因子不同, 在堿性條件下, FA為主要抑制因子;在酸性條件下, 離子化的氨氮為主要的抑制因子.

　　4) 在相同氨氮抑制濃度下, 與短期試驗相比較, 長期抑制條件下DAMO細菌脫氮速率更低.氨氮濃度增加到1250 mg·L-1時, 脫氮性能就被完全抑制.

　　5) 高通量測序技術分析結果顯示, 經長期的氨氮抑制后, DAMO系統內的物種多樣性和豐度都大大降低, 菌群結構發生較大改變, 變形菌門比例明顯上升, 綠菌門、綠彎菌門及浮霉菌門比例下降.尤其是Methylomonas(甲基單胞菌屬)數量的減少, 導致了系統脫氮效率降低.(來源：環境科學學報 作者：樓菊青)