城市垃圾焚燒發電廠垃圾滲濾液具有色度高, 懸浮物含量高, COD值常高達15 000~20 000 mg·L-1, BOD5/COD在0.3~0.5之間, 可生化性好, 氨氮濃度可達1 500~2 000 mg·L-1等特點.目前其常用的處理方法為“生物法+膜過濾”.生物法是比較經濟易行的處理垃圾滲濾液的方法, 其利用活性污泥中的大量微生物可有效去除垃圾滲濾液中的有機物, 氨氮和重金屬.但目前影響該工藝運行的一個主要問題是活性污泥造成的膜堵塞. Ishizaki等在MBR處理城市污水中發現了一些易導致膜污染的細菌菌屬, 它們的主要共同特征是會形成凸狀菌落, 擁有腫脹矮胖的形狀和平滑光澤的表面, 結合有大量水分子、親水有機物質和碳水化合物.張崇淼等發現屬于真菌的青霉菌屬(Penicillium)、毛孢子菌屬(Trichosporon)等是導致城市污水廠污泥膨脹的主要微生物.呂文洲等也從處理含油廢水的膨脹污泥中分離得到真菌白地霉.以上均說明微生物種群結構會影響污泥過濾性能.如果MBR系統中絲狀真菌過度繁殖時(即發生污泥膨脹), 在膜表面會形成致密無孔的泥餅層且污泥層較厚, 加劇膜污染.而李艷娜等指出之所以會發生絲狀菌污泥膨脹是因為活性污泥微生態系統平衡失調, 微生物種群結構發生變化, 絲狀菌種群大量生長成為優勢種.
為了維持活性污泥的生態穩定, 研究處理垃圾滲濾液的活性污泥系統中的微生物組成, 抑制該條件下絲狀菌屬的大量繁殖, 對控制膜污染有重要作用.其中誘導絲狀菌大量生長的原因有多樣, 比如營養物質的缺乏, 溶解氧過低, pH值偏低.但太陽光照對絲狀菌的影響卻很少有人研究.基于目前一些垃圾滲濾液處理廠考慮進行好氧池加蓋的現狀, 研究太陽光照對微生物種群的影響很有必要.
高通量測序技術以一次能并行對幾十萬至幾百萬條DNA分子進行測序和一般讀長較短等為標志, 具有高準確性, 高通量, 高靈敏度和低運行成本等突出優勢, 能夠對樣品中所含微生物進行全面檢測, 在海量數據的基礎上對微生物組成的種類和相對豐度進行分析, 在環境微生物鑒定領域的應用越來越廣泛.
因此本研究采用兩組SBR反應器(SBR1和SBR2)進行試驗, SBR1置于太陽光照下, SBR2置于室內黑暗處, 兩者進水水量和水質均相同, 工藝運行參數和曝氣方式也相同.定期監測兩反應器內污泥的比阻值, 同時利用高通量測序技術, 對兩反應器內的細菌和真菌群落組成進行分析, 從微生態的角度探討太陽光照對活性污泥的過濾性能的影響, 以期為活性污泥法在垃圾滲濾液處理上的應用提供理論幫助.
1 材料與方法
1.1 試驗裝置
試驗用SBR材質均為有機玻璃, 可透光, 兩反應器中污泥混合液容積均為30 L. SBR1和SBR2采用相同的運行方式、進水量和進水水質, 初期污泥濃度也相同. SBR1和SBR2的運行工藝參數如下：每天曝氣20 h, 靜沉3.5 h, 排水和進水0.5 h.運行期間反應器內污泥混合液溶解氧濃度為4.5~5.6 mg·L-1, pH值為7.6~8.6, 水溫為20~25℃(隨環境溫度而變), 污泥有機負荷(以COD/MLSS計)為0.12~0.24 g·(g·d)-1.
但SBR1放置在窗戶邊, 太陽光照充足, SBR2放置在室內角落, 幾乎無太陽光照.
1.2 接種污泥和試驗用水
接種污泥取自漳州市開發區生活污水處理廠好氧池, 試驗用水為垃圾滲濾液原液, 取自漳州市浦江嶺生活垃圾焚燒發電場的滲濾液調節池.試驗期間垃圾滲濾液原液的COD值為30 618~36 456 mg·L-1, NH4+-N為947~1 868 mg·L-1, pH為7.0~7.5, 水溫為18~23℃.
試驗方案為：相同量的接種污泥投加至兩反應器中, 第1~2 d進行悶曝, 即每天曝氣20 h, 靜沉后排除上清液, 加自來水到原水位(維持總容積為30 L).第3 d開始, 每天曝氣20 h, 靜沉后排除上清液, 加1:10(滲濾液原液體積:自來水體積)稀釋后的垃圾滲濾液到原水位.第10 d開始, 每天曝氣20 h, 靜沉后排除上清液, 加2:9稀釋后的垃圾滲濾液到原水位.試驗期間, 每周測兩次污泥比阻值.
1.3 分析方法
常規分析項目(COD和NH4+-N)采用國家標準方法測定. pH、DO采用WTW Multi 3400(WTW Laborprodukte, GER)便攜分析儀測定; 污泥比阻采用污泥比阻裝置(PJK02, 上海江科)進行測定.
1.4 DNA抽提和PCR擴增
取SBR1和SBR2運行至第50 d時活性污泥樣品(此時兩反應器內污泥已呈現出了較大差別, SBR1出現輪蟲, SBR2發生了污泥膨脹), 經過真空凍干后碾碎提取DNA, DNA的提取采用FastDNA® SPIN Kit for Soil(Qiagen, CA, USA)試劑盒.用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對細菌16S rRNA V3, V4區進行PCR擴增, 擴增程序為：95℃預變性3 min, 27個循環(95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s), 最后72℃延伸10 min.用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGA GGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCA TCGATGC-3′)引物對真菌ITS區進行PCR擴增, 擴增程序為：95℃預變性3 min, 35個循環(95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s), 最后72℃延伸10 min. PCR儀為GeneAmp® 9700型(美國ABI公司), 擴增體系為20 μL：4 μL 5×FastPfu緩沖液, 2 μL 2.5 mmol·L-1 dNTPs, 0.8 μL引物(5μmol·L-1), 0.4 μL FastPfu聚合酶; 10 ng DNA模板.
1.5 Illumina MiSeq測序和數據處理
使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物, 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)進行純化, Tris-HCl洗脫, 2%瓊脂糖電泳檢測.利用QuantiFluorTM-ST (Promega, USA)進行檢測定量.根據Illumina MiSeq平臺(Illumina, San Diego, USA)標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫.
利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(上海美吉生物醫藥科技有限公司)進行測序.使用UPARSE軟件, 根據97%的相似度對序列進行OTU聚類; 使用UCHIME軟件剔除嵌合體.利用RDP classifier 對每條序列進行物種分類注釋, 比對16S細菌Silva數據庫和ITS真菌Unite數據庫, 設置比對閾值為70%.
2 結果與討論 2.1 出水水質與污泥比阻
反應器運行期間SBR1和SBR2出水COD約在496~800 mg·L-1之間變化, COD去除率約為60%~78%. SBR1和SBR2出水NH4+-N均在10~20 mg·L-1之間波動, 氨氮去除率相接近且都維持在85%~95%.可見SBR1和SBR2對垃圾滲濾液中有機物和氨氮的去除效率相接近.
接種污泥的污泥比阻值為3.77×1012 m·kg-1. SBR1和SBR2的污泥比阻變化見圖 1.污泥比阻越小說明污泥越易過濾.從圖 1中可以看出, SBR1中污泥比阻隨運行時間先升后降, 在第35 d時出現最大值.而SBR2中污泥比阻隨運行時間一直在升高.對兩反應器中的污泥進行鏡檢發現：SBR1在運行至第30~50 d時, 出現了大量輪蟲, 污泥比阻在第35 d出現開始下降, 而SBR2在運行至第40 d時, 出現了大量絲狀菌, 導致污泥比阻一直上升(見圖 2).
2.2 SBR1和SBR2中細菌群落差異 2.2.1 細菌多樣性差異
SBR1和SBR2進行細菌16S rRNA高通量測序, 共得到74 085條有效序列.在97%相似度下, SBR1和SBR2共得到321個OTUs.樣品稀釋性曲線如圖 3所示, 兩條曲線都趨于平坦, 表明測序結果涵蓋了樣品中絕大多數微生物信息. 圖 4為Venn圖, 從中可以看出, SBR1和SBR2共有的OTUs數為207, 占總OTUs的比例為64.48%, 表明兩者的細菌群落組成存在較大的相似性. SBR1獨有的OTUs占總數的21.81%, 略高于SBR2的13.71%.
表 1為SBR1和SBR2的細菌群落α多樣性指數. Chao指數與Shannon, Simpson指數可以反映出樣品中微生物的豐富度與多樣性. SBR1的Chao指數為287.5, 大于SBR2的259, 說明SBR1中細菌群落更加豐富. SBR1的Simpson指數為0.143, 大于SBR2的0.07, SBR1的Shannon指數為3.292, 小于SBR2的3.472, 說明SBR1中的細菌群落多樣性較SBR2低.
2.2.2 細菌群落組成差異
對樣品OTUs代表序列進行物種注釋, 并將樣品的有效序列劃分到不同的分類水平(從門到屬).兩反應器內污泥中相對豐度>1%的門如圖 5所示, 其中變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為兩反應器內的優勢細菌門, 在SBR1中所占百分比為64.27%和27.21%, SBR2中為57.92%和37.16%.厚壁菌門(Firmicutes)在SBR2中的豐度為2.75%, 大于SBR1中的0.52%, 浮霉菌門(Planctomycetes)和TM6在SBR1中的豐度分別為1.33%和2.62%, 而SBR2中幾乎沒有.從門水平上看出, SBR1的優勢門與SBR2大致相同, 在相對豐度上差異較小.
在屬水平, 進一步篩選相對豐度大于1%的屬(主要屬)進行分析, 具體結果見圖 6.
在SBR1中, 總共有15個主要屬, 其總的相對豐度為80.07%.其中, β-變形菌門紅環菌科(Rhodocyclaceae)Thauera菌屬為最為優勢的菌屬, 相對豐度為39.35%, 其次為擬桿菌門黃桿菌目(Flavobacteriales)中未定義菌屬, 相對豐度為6.91%;擬桿菌門噬纖維菌科(Cytophagaceae)未分類菌屬, 相對豐度為6.14%;擬桿菌門黃桿菌目NS9_marine_group科菌屬, 相對豐度為5.32%.在SBR2中, 總共有16個主要屬, 其總的相對豐度為84.31%.其中, 擬桿菌門黃桿菌科(Flavobacteriaceae)Planktosalinus菌屬為最為優勢的菌屬, 相對豐度為16.84%, 其次為Thauera菌屬, 相對豐度為16.23%; β-變形菌門叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)Ottowia和Brachymonas菌屬, 相對豐度為12.55%和8.04%; γ-變形菌門黃單胞菌科Pseudofulvimonas菌屬, 相對豐度為7.49%; NS9_marine_group科菌屬, 相對豐度為3.49%.
主要菌屬在兩反應器內相對豐度相差較大, 比如Cytophagaceae未分類菌屬在SBR1中較多, 而Planktosalinus、Ottowia、Brachymonas以及Pseudofulvimonas在SBR2中較多.從圖 6中可以看出SBR1中Thauera菌屬是第一大優勢菌, 其他主要菌屬豐度都相對較低.而SBR2中幾大菌屬豐度相當, 紅環菌科Rhodocyclaceae的優勢地位有被黃桿菌科Flavobacteriaceae和叢毛單胞菌科Comamonadaceae替代的趨勢.
SBR1和SBR2均主要發生了有機物降解, 異養反硝化、自養反硝化和氨氧化過程.主要的功能菌屬為屬于β-變形菌門的Thauera、Ottowia和Brachymonas, 屬于擬桿菌門的Planktosalinus和一些未定義菌屬, 這與孫法遷和李衛華等的研究結果一致.其中Thauera是革蘭氏陰性細菌, 大都為桿狀且具有需氧反硝化能力.目前分離到的Thauera大約有60株,是一類廣泛存在于各種類型的廢水處理裝置中并具有多種芳香族污染物降解能力和好氧反硝化能力的重要功能菌群.菌種Thauera sp. strain TN9可以同時去除豬場廢水中的COD和氨氮, 不產生亞硝態氮和硝態氮的積累. Thauera也同樣存在于處理垃圾滲濾液的同步硝化反硝化脫氮污泥中, 且為優勢菌屬.以上說明SBR1和SBR2中的功能菌屬Thauera可能起到了異養硝化和好氧反硝化脫氮的作用.目前已報道的具有異養硝化和好氧反硝化功能的菌屬有約10種. Thauera在SBR1中的豐度大于SBR2, 可能是因為SBR1由于太陽光照的影響具有更高的溶解氧, 使好氧反硝化菌占優勢. 端正花等發現在某污水處理廠發生污泥膨脹的優勢菌之一為黃桿菌科(Flavobacterium), 而SBR2中Flavobacterium也為優勢菌科, 這說明SBR2出現了污泥膨脹.
SBR2中主要菌屬Ottowia目前已分離出3個種：Ottowia thiooxydans 是從活性污泥系統中分離出的兼性厭氧菌, 可以進行反硝化作用產生N2O; Ottowia pentelensis是從焦化廢水活性污泥系統中分離出的可形成絮狀的細菌; Ottowia beijingensis AN3T也是從焦化廢水活性污泥系統中分離出的可降解酚類的好氧菌, 無鞭毛, 不運動. SBR2中主要菌屬Brachymonas具有亞硝酸鹽還原酶基因(nirS), 可以進行反硝化作用, 說明SBR2中同時出現了NO2-. SBR2中主要菌屬Pseudofulvimonas也可能具有異養硝化和好氧反硝化功能.同時李衛華對填埋場垃圾穩定化序批式生物反應器后期的主要脫氮功能微生物多樣性進行分析發現氨氧化細菌存在高度多樣性, 大部分為未知類群, 且均為不可培養菌或未經分離獲得的細菌.目前也已發現很多異養微生物可以進行硝化作用.因此可能還有很多發生硝化作用的菌屬未被此次測序分析出來.但是反硝化功能菌Thauera、Ottowia和Brachymonas的大量存在, 可以從微生物角度說明SBR1和SBR2有較高的脫氮效率.
Cytophagaceae可分解藻類纖維素, 而SBR1中由于太陽光照的影響, 應該出現了藻類, 使其豐度較高.
采用卡方檢驗對兩個樣本間的物種的豐度差異進行比較, 見圖 7, 其中Pvalue值越接近0, 物種豐度差異顯著性越大.
2.3 SBR1和SBR2中真菌群落差異 2.3.1 真菌多樣性差異
SBR1和SBR2進行真菌ITS區高通量測序, 共得到73 951條有效序列.在97%相似度下, SBR1和SBR2共得到22個OTUs.樣品稀釋性曲線如圖 8所示, 兩條曲線都趨于平坦, 表明測序結果能夠覆蓋樣品中絕大多數微生物信息. 圖 9為Venn圖, 從中可以看出, SBR1和SBR2共有的OTUs數為8, 占總OTUs的比例為36.36%, SBR2獨有的OTUs占總數的45.45%, 遠大于SBR1的18.18%, 表明兩者的真菌群落結構存在較大的差異性.
表 2為SBR1和SBR2中真菌群落α多樣性指數表. SBR2的Chao指數為18, 大于SBR1的12, 說明SBR2中真菌群落更加豐富. SBR2的Simpson指數為0.964, 大于SBR1的0.726, SBR2的Shannon指數為0.126, 小于SBR1的0.469, 說明SBR2中的真菌群落多樣性較SBR1低.
2.3.2 真菌群落組成差異
兩反應器內相對豐度>1%的真菌門如圖 10(a)所示, SBR1中Rozellomycota為第一優勢菌門, 相對豐度為83.71%, 擔子菌門(Basidiomycota)為第二優勢菌門, 相對豐度為16.24%;而SBR2中Basidiomycota為唯一優勢菌門, 相對豐度為99.84%.從門水平上看出, SBR1的優勢門與SBR2大不相同, 且同一優勢門在相對豐度上差異較大.
真菌在屬水平上的相對豐度見圖 10(b), SBR1中的第一優勢屬為Rozellomycota下未定義屬, 其相對豐度為83.71%, 其次為Basidiomycota菌門下Trichosporon菌屬, 其相對豐度為16.22%.在SBR2中, Basidiomycota菌門的Trichosporon是唯一優勢屬, 其相對豐度為99.78%.可見, SBR2中的優勢菌屬單一, 且相對豐度與SBR1中的差異較大. Trichosporon是一種產油脂微生物, 能夠將碳水化合物與普通的油脂轉化為微生物油脂儲存在體內, 其大量存在會使得污泥過濾性能變差, 污泥黏性增加.張崇淼等也發現Trichosporon是導致城市污水廠污泥膨脹的主要微生物.在培養條件下, 可觀察到Trichosporon形成了不規則的絲狀菌體.而Trichosporon在SBR2中成為唯一優勢真菌, 可能是因為SBR2中的環境有利于其生長.
真菌菌屬卡方檢驗分析結果見圖 11.
2.4 污泥比阻與微生物種群的關系
SBR1中污泥比阻由于輪蟲的出現而下降, SBR2中污泥比阻由于活性污泥的絲狀膨脹而一直上升, 且遠遠大于SBR1中的.高通量測序結果表明, 兩反應器內細菌群落組成差異較小(共有OTUs占總OTUs的比例高達64.48%), 真菌群落組成差異較大(共有OTUs占總OTUs的比例為36.36%), 說明反應器內污泥過濾性能的差異應該主要是由真菌種群差異引起的.
SBR1由于有太陽光照射, 活性污泥生態系統微生物種群豐富, 原生和后生動物(輪蟲)與菌膠團共存, 微生物結構合理.真菌群落多樣性較SBR2高, 真菌中的Rozellomycota成長為優勢菌門, 沒有出現活性污泥絲狀膨脹.后生動物(輪蟲)的出現改善了污泥的過濾性能, 使污泥比阻下降.據李艷娜等[7]和梁少博等的研究, 輪蟲等后生動物可捕食分散絮狀污泥和絲狀菌, 從而提高污泥沉降性能和過濾性能.因此SBR1中輪蟲的出現應該是其污泥比阻下降的主要原因.
而SBR2沒有太陽光照射, 真菌群落豐度較SBR1高, 但菌屬結構單一, Basidiomycota菌門的Trichosporon成長為唯一優勢屬, 相對豐度為99.78%, 說明SBR2中的活性污泥膨脹很可能是由Trichosporon菌屬大量生長引起的. SBR2中微生物代謝產物的積累和微生物種群結構單一, 打破了原活性污泥微生態系統的平衡, 可能造成了Trichosporon菌屬的大量生長.
兩反應器的進水條件和運行參數都保持相同, 實際運行時SBR1的DO值(5.63)略高于SBR2(5.04), 混合液的pH值SBR1為8.45, SBR2為8.63, 都呈中性.關于混合液的水溫, SBR1因為有太陽光照, 白天溫度比SBR2高1~2℃, 但都維持在20~25℃之間, 因此兩反應器內的微生物種群的差異應該是由太陽光照引起的.太陽光照使活性污泥系統中微生物種群豐富, 利于后生動物的出現, 從而抑制真菌Trichosporon的大量生長, 維持微生物生態系統的平衡和穩定.
3 結論
(1) SBR1由于有太陽光照射, 細菌群落豐度較SBR2高, 第一主要菌屬為β-變形菌門的Thauera屬, 相對豐度為39.35%, 是去除有機物和脫氮的主要功能菌; 真菌群落多樣性較SBR2高, Rozellomycota成長為優勢真菌菌門, 相對豐度為83.71%.污泥比阻隨運行時間先升后降, 大量輪蟲的出現使污泥比阻開始下降.
(2) SBR2由于沒有太陽光照射, 細菌群落豐度較SBR1低, 但多樣性較SBR1高, Thauera也同樣存在于SBR2中, 且是第二優勢菌屬, 相對豐度為16.23%;擬桿菌門下的Planktosalinus為第一優勢菌屬, 相對豐度為16.84%, 其存在預示活性污泥出現膨脹; β-變形菌門Ottowia和Brachymonas菌屬是去除有機物和脫氮的主要功能菌, 相對豐度分別為12.55%和8.04%. SBR2真菌群落豐富, 但菌屬結構單一, Basidiomycota下的Trichosporon成長為唯一優勢真菌菌屬, 相對豐度為99.84%, 說明SBR2中的污泥膨脹跟Trichosporon大量生長有關.具體聯系污水寶或參見http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。
(3) 在低負荷SBR中, 太陽光照有利于維持微生物生態系統的平衡和穩定, 抑制活性污泥出現膨脹.
