污水處理廠污水成份復雜，常含有一些難以降解的微量污染物，例如關注較多的農藥、醫藥、個人護理品以及內分泌干擾物等.污水處理廠出水在達到現行常規指標要求時，對這些微量污染物的去除效果并不佳.因此，污水廠出水成為水環境中微量污染物的主要來源.這些微量污染物進入水環境后會影響水生生物的正常生長、發育、繁殖，進而導致生態系統結構破壞.通常，人們采用一些化學分析法對水樣中的微量污染物進行定性或者定量分析，例如高效液相色譜、氣相色譜、高效液相色譜-質譜法等.但這些化學分析方法需要較高的費用以及熟練的操作技術，并且這些微量污染物共存于水環境時，可能會產生拮抗、協同或者加和作用，故單個物質濃度不能反映水樣的生物效應.目前，污水處理廠出水成為水環境健康的一個重要的潛在危險源.例如，Sponza發現紙漿和造紙廠出水達到了行業的排放標準，但生物毒性檢測結果發現其對魚類和藻類具有急性毒性.周海東等研究表明污水處理廠雖能較好地去除內分泌干擾物，但污水廠的出水仍具有潛在的環境風險.為實現城市污水的資源化和無害化，有必要對污水處理前后的生物毒性進行全面的檢測和評價.多數研究采用不同類型的單一生物毒性方法對工業廢水和生活污水進行評價，而利用成組生物實驗并采用綜合毒性評價方法對污水毒性削減程度進行評價的研究尚缺乏.

　　本研究利用發光菌急性毒性實驗、遺傳毒性實驗和雌激素活性實驗檢測了A2/O工藝對城市生活污水毒性的去除效果，并采用水質安全分級法對生物毒性進行綜合評價;同時通過雄性斑馬魚暴露實驗分析了水樣對水生生物產生內分泌干擾作用的機制，以期為污水處理工藝運行參數優化及工藝改進提供理論依據，進一步保障受納水體的生態安全.

　　1 材料與方法 1.1 實驗試劑

　　苯酚(phenol)、4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NOQ)、鄰硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG) 和雌二醇(E2) 購自Sigma公司. HPLC級甲醇、乙酸乙酯購于天津科密歐公司.

　　1.2 水樣的采集和預處理

　　從污水處理廠的細格柵、曝氣沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水(加氯消毒后，如圖 1) 各采集3 L水樣于棕色玻璃容器中，并立即帶回實驗室進行預處理.其中1 L水樣用于發光菌急性毒性和遺傳毒性實驗，2 L水樣用于雌激素活性檢測和斑馬魚暴露實驗.水樣經玻璃纖維膜(0.8 μm, Millipore, GF/F) 過濾后進行固相萃取.水樣中的諸如雌二醇(E2)、雌酮(E1)、雌三醇(E3) 以及雙酚A等雌激素或類雌激素屬于弱極性物質[11]，根據相似相溶原理，針對不同的生物毒性，本研究采用不同的萃取方法，具體步驟如下.

圖 1 A2/O工藝流程及取樣點

　　對于發光菌急性毒性和遺傳毒性實驗，水樣的萃取方法參照Ma等的研究，依次用14 mL甲醇、10 mL超純水活化Oasis HLB (200 mg，6 mL，Waters) 柱子;水樣以流速5~10 mL·min-1過柱，然后用10 mL超純水清洗管路，干燥30 min，離心15 min去除水份;進樣完畢，用10 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮氣吹干;最后用1% DMSO將殘留物溶解，定容至5 mL用于實驗.

　　對于雌激素活性和斑馬魚暴露實驗，水樣的萃取方法參照王昌穩等的研究，依次用10 mL乙酸乙酯、10 mL甲醇和10 mL超純水對上述柱子進行活化;水樣以流速5~10 mL·min-1過柱，然后用10 mL超純水清洗管路，干燥30 min，離心15 min去除水份;進樣完畢，用10 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液用氮氣吹干;最后用1 mL純DMSO溶解濃縮至2 000倍，吸取其中500 μL濃縮液用于雌激素活性，剩余濃縮液稀釋至400 mL (濃縮2.5倍) 用于斑馬魚暴露實驗.

　　1.3 發光菌急性毒性實驗

　　發光菌毒性測試采用國際標準ISO 11348急性毒性15 min暴露方法，實驗菌種為費氏弧菌(購自中國工業微生物菌種保藏管理中心).實驗前將保存的菌種轉接于50 mL的液體培養基中，在20℃，180 r·min-1條件下進行培養，當其處于對數生長后期時，用2% NaCl稀釋菌液使其相對發光值為300~400萬RLU;將100 μL濃縮的樣品、陽性對照(苯酚) 以及100 μL菌液加入96孔板，在檢測儀上高速振蕩30 s，搖勻，暴露15 min后測定發光值.每個樣品設置3個平行，并設置板間平行.樣品的RLU平均值記為I，空白對照的RLU平均值記為I0.根據公式(1) 計算不同濃縮倍數的污水的發光抑制率E.

　　1.4 遺傳毒性實驗

　　本實驗采用由Oda博士(日本大阪府立公共衛生研究所) 提供的鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimuriumTA1535/pSK1002菌株，具體實驗方法參照ISO 13829將新下平板的菌株接種到LB培養基中，在37℃，180 r·min-1條件下培養，當其在600 nm的吸光度為2.2±0.2時，用TGA稀釋10倍，放置搖床培養1.5~2 h，使菌液在600 nm的吸光度為0.75±0.5. 96孔板1板中B~H排加入1%的DMSO 180 μL，A排加入濃縮的樣品360 μL，用排槍混勻后吸出180 μL加入B排，混勻，再吸出180 μL至C排，依次至F排. G排為溶劑對照(1% DMSO)，H排為陽性對照(4-NOQ) 和空白對照.除空白外，每孔加入70 μL菌液，37℃下振蕩培養2 h. 1板結束后，每孔取30 μL加至含有270 μL TGA培養基的96孔板2板中，37℃下振蕩培養2 h，用酶標儀測定600 nm的吸光度.從2板每孔取30 μL加至含有120 μL B-buffer的96孔板3板中. 3板每孔加30 μL ONPG，28℃下振蕩培養0.5 h，最后加入120 μL Na2CO3終止反應，用酶標儀測定420 nm的吸光度.實驗過程未加S9代謝活化劑.實驗設置3個平行，并設板間平行，根據公式(2) 和公式(3) 計算結果:

　　式中, G為生長因子，IR為誘導率;G>0.5時可用于計算IR;IR≥1.5可判斷致突變陽性;A600, T、A600, B、A600, N、A420, T、A420, B、A420, N分別為測定樣品、空白對照和溶劑對照在600 nm、420 nm處的光密度值.

　　1.5 雌激素活性

　　雌激素活性采用中國科學院生態環境研究中心建立的酵母菌雌激素活性評價方法.將酵母菌置于SD培養基中，30℃、130 r·min-1條件下培養36 h.用SD培養液稀釋菌液，使其在600 nm的吸光度值為0.75左右，吸取995 μL菌液于1.5 mL滅菌離心管中，加入5 μL待分析的樣品混勻，每個樣品設置8個濃度.取200 μL的混合菌液到96孔板中，每個濃度設置3個平行，30℃、800 r·min-1條件下暴露4 h.測定菌液600 nm的吸光度，隨后每孔棄去150 μL，加入120 μL測試緩沖液和20 μL氯仿，1 200 r·min-1振蕩15 min，然后加入40 μL ONPG，于30℃、800 r·min-1下培養，顯色60 min后，每孔加入100 μL碳酸鈉溶液，終止反應.吸取上清液200 μL至新96孔板中，測定420 nm的吸光度.同時以DMSO做溶劑對照，E2為陽性對照. β-半乳糖苷酶活性(U) 按公式(4) 計算:

　　式中，t為加入ONPG到溶液顯色時的反應時間，60 min;V為菌液體積，0.2 mL;A600、A420分別為菌液在600 nm、420 nm處的光密度值;A′420為空白對照在420 nm的光密度值;D為稀釋因子(6.6).

　　由劑量效應曲線得出β-半乳糖苷酶活性(U) 后，根據最小二乘法如公式(5) 計算水樣的EC50.

　　式中，y為β-半乳糖苷酶活性;X為水樣濃縮倍數;A為最大β-半乳糖苷酶活性;B為回歸曲線中點的斜率;C為半數最大β-半乳糖苷酶活性時水樣的濃縮倍數(EC50);D為本底β-半乳糖苷酶活性.

　　1.6 水質安全分析

　　由于水體中污染物種類繁多，每種物質引起的毒性不同，因此選用多組生物毒性檢測方法進行評價更有意義. Xu等建立了基于多種生物毒性檢測的水質安全評價方法，本文采用該方法對水樣進行評價，具體方法如下:通過對傳統風險外推法進行改進，提出毒性的4個得分指標: 1、2、3、4;數字越大，毒性越強.根據引起顯著毒性效應的水樣最低濃度將毒性測試結果轉化為毒性得分，在此基礎上，對水樣的3種毒性得分進行匯總，提出水質安全分級指標A、B、C、D，水質安全性依次降低，由毒性測試結果中最差的得分值確定水質的安全級別.將各生物毒性結果用當量表示，樣品的毒性當量與陽性對照的可預測無效應濃度(PNEC) 進行對比，參照水質分析標準確定樣品的得分如表 1所示.在本研究中，陽性對照的PNEC值基于物種敏感性分布(SSDs).

　　表 1 水質安全性評價指標1)

　　1.7 斑馬魚暴露實驗

　　將6條馴化良好的成熟雄性斑馬魚暴露于400 mL濃縮2.5倍的水樣中(污水廠進水、二級出水以及地表水進水) 和空白(DMSO<0.01)，并設置3個平行.每48 h更新一次溶液，暴露周期為8 d，暴露期間未喂食.在暴露終點時，隨機取出5條斑馬魚，并立即轉移至冰塊上麻痹，待其凍僵后，用蒸餾水清洗魚體，解剖鏡下解剖，取出肝臟和生殖腺，迅速放入預冷的TRIzol試劑中，用RNA試劑盒(Takara, Japan) 提取肝臟和生殖腺的總RNA.用微量分光光度計測定RNA在260 nm和280 nm的吸光值A260和A280，當A260/A280的比值介于1.8~2.0之間時，方可用于實驗.經反轉錄提取的RNA轉錄成cDNA.在GenBank上查得斑馬魚雌激素受體(esr1) 和卵黃原蛋白基因(vtg1) 的mRNA序列.實驗選取不受環境和組織器官影響的18S rRNA作為參比引物，引物使用前用無菌ddH2O稀釋到10 μmol·L-1.定量PCR的過程參考文獻[17]進行操作.最終結果用相對定量2-ΔΔCt計算.

　　1.8 數據處理

　　發光菌急性毒性和雌激素活性用半數效應濃度EC50表示，而遺傳毒性用“遺傳毒性潛力值” IR1.5定量比較水樣的遺傳毒性大小.為了便于不同樣品間進行比較，將所有樣品的毒性折算成具有相同效應的陽性對照的濃度，其中發光菌毒性和遺傳毒性當量分別用TEQphenol、TEQ4-NOQ表示，雌激素活性用EEQE2表示，即TEQphenol=EC50-phenol/EC50-樣品、TEQ4-NOQ=IR1.5-4-NOQ/EC50-樣品、EEQE2=EC50-E2/EC50-樣品.斑馬魚暴露實驗結果采用GraphPad®Prism5軟件進行作圖.利用Newman-Keuls方法進行處理組和對照組之間的差異性分析，P≤0.05表示具有顯著性差異.

　　2 結果與討論 2.1 發光菌急性毒性

　　水樣對發光菌的發光抑制的劑量-效應曲線如圖 2所示.在本實驗中，陽性對照苯酚的EC50為2.82 mmol·L-1，與袁星等[19]研究結果相接近(2.35 mmol·L-1)，驗證了該方法的可靠性.各樣品毒性采用濃縮倍數N表示，當抑制率為50%時，進水、曝氣沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水的濃縮倍數N分別為1.44、0.94、1.86、12.67、12.79、24.70.將樣品毒性結果用TEQphenol表示，以上樣品的TEQphenol分別為184.97、283.36、143.59、21.03、20.83、10.78 mg·L-1.毒性由大到小依次為:曝氣沉砂池>進水>初沉池>好氧池>二沉池>出水.本實驗中曝氣沉砂池的毒性大于進水毒性，這可能是由于一些物質以共軛的形式存在于環境中，而經過曝氣沉砂池時變成非共軛形式或者被激活而表現出毒性，最終出現曝氣沉砂池的急性毒性增加的現象.總體而言，隨著工藝流程的進行，發光菌急性毒性降低.尤其是經過好氧池后，發光菌急性毒性降低92.58%.由此可以得出二級生物處理能大幅度降低污水的急性毒性.經過加氯消毒后，出水的毒性降低48.24%.王麗莎等[9]利用發光菌毒性測試對某污水廠再生水處理工藝進行測定，發現進水發光菌發光抑制率為63%，二沉池出水為0%，加氯消毒后提高到93%，說明加氯消毒能增大出水毒性.塔春紅等研究表明在正常濃度水平下的無機副產物(ClO2-和ClO3-) 均不表現出急性毒性，消毒后生物毒性的增加主要由消毒副產物引起.而投氯量是影響消毒副產物產生的一個重要因素.該處理工藝可能存在氯投加量過多的現象，導致有些消毒副產物同余氯發生反應或者降解，消毒副產物生成量增加后出現減小的趨勢，造成急性毒性降低.

　　2.2 遺傳毒性

　　本實驗以4-NOQ為陽性對照，其IR1.5-4-NOQ的值為19.58 μg·L-1.當4-NOQ的濃度為50 μg·L-1，IR的值為3.38，與國際標準ISO13829具有可比性，說明該方法的可行性.水樣的遺傳毒性的劑量-效應曲線如圖 3所示，當IR=1.5時，進水、曝氣沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水的濃縮倍數N分別為1.15、0.92、1.89、43.79、48.64、111.50.將上述樣品的遺傳毒性用TEQ4-NOQ表示，分別為17.02、21.28、10.36、0.447、0.403、0.17 μg·L-1.遺傳毒性的順序依次為:曝氣沉砂池>進水>初沉池>好氧池>二沉池>出水.在本實驗中，曝氣沉砂池的遺傳毒性大于進水，這可能是由于曝氣沉砂池的曝氣和水流的螺旋旋轉作用，使污水中懸浮顆粒相互碰撞、摩擦，并受到氣泡上升的沖刷作用，導致砂粒上附著的有機成分被剝離而溶于水中引起.除曝氣沉砂池以外，隨著工藝流程進行遺傳毒性降低.其中，好氧池對遺傳毒性的去除率高達95.68%，因此二級處理工藝能夠顯著地降低遺傳毒性.加氯消毒后，污水出水的遺傳毒性降低57.82%，該結果和污水對發光菌的熒光抑制毒性具有一致性.造成加氯消毒后遺傳毒性降低的原因如發光菌急性毒性所述，投氯量較多時，消毒副產物被分解.

圖 3 水樣的遺傳毒性的劑量-效應曲線

　　2.3 雌激素活性

　　本實驗中陽性對照E2的EC50為15.05 ng·L-1，與Beck等[26]研究相比(EC50=48.96 ng·L-1)，該方法的靈敏度較高，適用于廣范圍的水樣類型.水樣的β-半乳糖苷酶活性的劑量-效應關系如圖 4所示.水樣的雌激素活性用濃縮倍數N表示時，進水、曝氣沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水的EC50分別為2.07、2.02、2.45、7.57、8.29、7.89.將上述樣品用EEQE2表示時，其EEQE2分別為7.29、7.45、6.15、1.98、1.82、1.89 ng·L-1.與急性毒性、遺傳毒性類似，曝氣沉砂池的雌激素活性最強.人體的尿液中，雌激素以共軛的形式存在，通過物質之間的化學作用或者微生物酶的作用，曝氣沉砂池中的雌激素以自由態的形式被釋放，這可能導致雌激素活性增加.整體而言，雌激素活性也隨著流程的進行逐漸降低.其中，好氧池對雌激素活性的去除率高達72.84%.這種去除效果可能是由于微生物的降解和污泥的吸附作用.尤其是A2/O工藝具有延長生物處理的特點，在脫氮除磷過程中，氨氧化菌可將雌激素物質硝化，進而產生雌激素活性較低的產物，如E1和E2的硝化產物的活性低于母體本身.而加氯消毒沒有降低出水的雌激素活性，這可能是由于在消毒過程中產生的消毒副產物具有雌激素活性, 從而導致出水的雌激素活性比較恒定的現象，例如E1、E2和EE2的消毒副產物具有與母體相當的雌激素活性.

圖 4 水樣雌激素活性的劑量-效應曲線

　　Jarošová等指出當水環境的EEQE2高于1 ng·L-1會對水生生物產生一定的危害. Vethaak等[32]曾報道河流的EEQE2為0.17 ng·L-1時，可導致雄魚體內卵黃原蛋白顯著性上升.本實驗污水的出水的EEQE2為1.89 ng·L-1, 故其有可能對受納水體的水生生物產生潛在的危害.

　　2.4 水質安全評價

　　在3種體外生物毒性測試的基礎上，通過SSD法計算得出PNECphenol為2.94 mg·L-1，參照Xu等得出的PNEC4-NOQ(0.64 μg·L-1) 和PNECE2(2 ng·L-1) 值，結合水質風險分級評價方法，對各流程出水進行了水質安全評價研究，結果如圖 5所示.進水的生物毒性得分最高，其中急性毒性和遺傳毒性得分為3，雌激素活性得分為2[圖 5(a)]，水質安全級別為C級，屬于較差的水質.經曝氣沉砂池和初沉池處理后，污水水質安全級別并沒有提高[圖 5(a)].經過好氧池處理之后，發光菌毒性得分為2，遺傳毒性和雌激素活性得分為1，水質級別提高到B級[圖 5(b)]，經二沉池和加氯消毒處理之后，出水水質安全性沒有得到進一步改善，水質級別仍為B級[圖 5(b)].顯然污水的雌激素活性對水質安全性影響最小，而發光菌急性毒性對其影響最大.由此可知，根據污染物具有的主要生物毒性效應而采取針對性的處理工藝更有利于水質達到安全性級別.本實驗中，雖然生物毒性都得到降低，但污水的急性毒性效應未使出水水質達到安全性級別，可能會對周圍的生態環境產生潛在的生態危害.

圖 5 污水各處理工藝出水的安全性級別

　　2.5 斑馬魚暴露實驗

　　綜上所述，污水出水仍會對受納水體的水生生物帶來一定的風險.本研究進一步通過雄性斑馬魚實驗了解水樣對水生生物的毒性機制.實驗過程中斑馬魚未出現死亡.雄性斑馬魚的肝臟和生殖腺內的esr1基因和vtg1基因表達如圖 6所示.污水廠進水、二級出水以及地表水進水濃縮2.5倍后，導致雄性斑馬魚肝臟和生殖腺的vtg1表達上升[圖 6(a)和6(c)]. vtg1的誘導是卵生脊椎動物體內出現雌激素效應的一個標志.因此本實驗表明了水樣對雄性斑馬魚產生雌激素效應.研究過程中，通過化學分析檢測到水樣中的主要雌激素為E2和乙炔雌二醇(EE2)(數據待發表)，地表水進水中的E2和EE2濃度接近EC50(導致斑馬魚體內卵黃原蛋白基因表達量達到最大值一半時的濃度). Thorpe等指出將斑馬魚暴露在濃度為1 ng·L-1的EE2和E2時，可觀察到卵黃原蛋白的生成.因此，本實驗中雄性斑馬魚體內vtg1的增加是持續暴露在水樣中的必然結果.

圖 6 暴露在進水、二級出水和地表水進水中的雄性斑馬魚生殖腺和肝臟的目的基因(esr1和vtg1) 的變化

　　生殖腺中的esr1的表達受到抑制[圖 6(b)]，說明水樣對雄性斑馬魚具有抗雌激素效應.該結果和酵母菌體外檢測相反，這可能由以下兩方面原因引起:首先，水樣成份復雜存在抗雌激素物質，如4-n壬基酚具有一定的抗雌激素作用;其次，生物體具有代謝能力，一些物質體內的代謝產物可能比母體化合物具有更強的生物毒性，例如防曬劑二苯甲酮-3作為二苯甲酮-4的代謝產物具有更強的抗雌激素作用而較弱的雌激素作用.而酵母菌缺乏一定的代謝能力，可能會產生和體內檢測不一樣的結果.研究還發現雄性斑馬魚肝臟內的esr1有微弱的表達[圖 6(d)]，這個結果和vtg1的上升以及酵母菌檢測具有一致性，進一步說明了水樣的雌激素效應. esr1表達水平的變化說明了同一個基因在不同的組織器官的表達可能具有差異性.因此，在毒性效應分析時應從多個基因水平和多個組織或器官考慮，以獲得比較全面的信息.總之，體內檢測揭示了水樣對斑馬魚的內分泌干擾作用可通過干擾相關基因的表達來完成.具體參見污水寶商城資料或http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。

　　3 結論

　　(1) 初級處理對污水的急性毒性、遺傳毒性和雌激素活性的去除效果微弱，而二級生物處理對污水的生物毒性效應具有顯著的削減作用.

　　(2) 城市生活污水原水的水質安全性較差，其中發光菌急性毒性對水質安全性的影響較大，經A2/O工藝處理之后，出水水質安全性得到提高，但污水出水的雌激素活性水平仍會對受納水體的水生生物產生潛在的危害.

　　(3) 污水可通過干擾目的基因的表達來調控水生生物的內分泌且調控方式與組織器官相關.