造紙工業是環境污染大戶，生產過程中化學制漿、洗漿、漂白以及抄紙工序會產生大量的廢水。化學制漿產生的黑（紅）液廢水與抄紙白水，可通過常規的堿回收工藝以及氣浮、過濾等處理后直接回用于生產。洗漿、漂白段產生的中段廢水污染物成份復雜，除含有高濃度的較難生物降解的木質素、纖維素外，還含有對環境危害極大的低分子量氯代酚和色度很高的高分子量氯代木素衍生物、糖類、殘堿、無機鹽、揮發酸等，這段廢水COD高、pH變化幅度大、色度高、可生化性差，處理難度大，是真正意義上的造紙廢水。當前，采用常規的一級沉降與二級生化處理后，造紙廢水的污染負荷大幅降低，雖然也達到了外排標準，但水的色度與COD值仍然較高，水中仍含有一定量毒性很高的可溶性木素衍生物與多酚類物質，不僅達不到回用標準，外排還會對生態環境造成極大危害，因此，研究造紙廢水的深度處理就顯得非常必要。
漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，參與木素的降解或聚合，具有氧化木素的能力。在有氧條件下，漆酶能使造紙廢水中的木素衍生物和多酚類化合物發生氧化降解或聚合，進而通過絮凝沉淀或深度氧化除去，基于此，近年來用漆酶及產漆酶白腐菌深度處理造紙廢水成為研究熱點并取得了良好的效果。裂褶菌是一種珍貴的食、藥兩用真菌，研究證明，裂褶菌能分泌高活性的漆酶，而且裂褶菌漆酶在對紡織品染料進行脫色以及廢新聞紙的脫墨方面表現出良好的應用效果，但有關裂褶菌漆酶應用于造紙廢水處理方面的文獻并未見報道。
本文在前期篩選到一株產漆酶裂褶菌mys005并通過液體發酵培養得到了高活力漆酶的基礎上，主要開展裂褶菌mys005漆酶的酶學特性及深度處理造紙廢水最佳工藝條件研究，以期為其工業化應用積累數據并為應用企業提供參考。
1、材料與方法
1.1 產漆酶菌種
采自秦嶺驪山，在愈創木酚-PDA培養基平板上產生深棕紅色變色圈，在α-萘酚PDA培養基平板上不產生變色圈；真菌ITS分子鑒定為裂褶菌（Schizo⁃phyllumcommuneFr.）,所內編號mys005。
造紙廢水取自陜西某廢紙制漿造紙廠綜合廢水經生化處理后的二沉池出水（廢水水質：木素121mg/L，色度（倍）238，COD304mg/L，pH6.7）。
1.2 藥品、儀器與設備
實驗所用到的藥品均為分析純（天津百世化工）與生化級試劑（北京奧博星）；ABTS（2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽）為Sigma試劑；HBT（1-羥基苯并三唑）購自國藥集團試劑公司；BeckmanDU640紫外分光光度計；慍溫搖床：KYC-1102上海新苗醫療器械有限公司；慍溫培養箱：PYS-DHS上海躍進醫療器械廠；恒溫水浴箱：HH•W21•600S上海躍進醫療器械廠。
1.3 方法
1.3.1 漆酶液的制備
mys005斜面菌種用PDA平板活化2~3d后無菌操作打成￠6mm菌餅，接入搖瓶（500mL錐形瓶裝培養液150mL，接菌餅5片/瓶），于30℃搖床200r/min培養9d，發酵液先用脫脂棉過濾然后再于10000r/min離心10min得漆酶液。搖瓶培養基（20%馬鈴薯濾汁1000mL、K2HPO4•3H2O1.00g、NaCl0.50g、MgSO4•7H2O0.50g、NaNO32.50g、CaCl2•2H2O0.10g、FeCl30.02g、吐溫-801.20mL，微量元素復合液（50mg/mLCuCl2•2H2O+20mg/mLMnSO4•7H2O+10mg/mLZnSO4•7H2O）3mL、洋蔥100g（切碎）、麥麩10g），pH4.5，121℃滅菌20min。
1.3.2 漆酶活測定方法：ABTS法
酶活定義：以每min轉化1μmol/LABTS的酶量為一個酶活單位（U）。
1.3.3 漆酶酶學特性研究
1.3.3.1 漆酶最適反應溫度
用1.3.2節方法，選擇在不同溫度下測定酶活，活力最高者為100%。
1.3.3.2 漆酶最適反應pH
用1.3.2節方法，選擇用不同pH的醋酸—醋酸鈉緩沖液測定酶活，活力最高者為100%。
1.3.3.3 漆酶的熱穩定性
取酶液在不同溫度下分別保溫不同時間，然后迅速冷卻到室溫，用1.3.2節方法測定酶活，以30℃測定的未保溫處理酶樣的酶活為100%。
1.3.4 漆酶處理造紙廢水研究
1.3.4.1 廢水處理方法
取200mL廢水樣于500mL錐形瓶中，調節pH，加入適量的漆酶液及介體HBT與水樣混勻，置于恒溫水浴進行處理，期間不間斷搖勻水樣，處理完成后將水樣用6層紗布過濾，收集上清液用于測定木素含量、COD及色度，計算降解率。
1.3.4.2 廢水木素含量的測定
由于木素的紫外吸收光譜在280nm處有特征吸收峰，因此，可以在波長280nm下定量地測定水樣中木素的含量（濃度）。計算公式如下：
式中：A為吸光度；a為吸收系數，此水樣吸收系數采用26.1L/（g•cm）；b為比色皿的厚度1cm；c為測定水樣中木素吸收濃度，g/L。
木素降解率（%）=×100
1.3.4.3 廢水COD和色度的測定
COD的測定采用重鉻酸鉀法（GB/T11914-1989）。色度測定采用稀釋倍數法（GB/T11903-1989）。
COD降解率（%）=×100
色度降解率（%）=×100
2、結果與分析
2.1 裂褶菌mys005漆酶酶學特性
由于不同菌種來源的漆酶具有其不同的最適反應溫度、最適pH、酶的熱穩定性等酶學特性，應用時要使酶發揮最佳催化效率，取得最佳處理效果，就有必要先對其酶學特性進行研究。
2.1.1 mys005漆酶最適反應溫度
將酶反應溫度分別設定為30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80℃測定漆酶活，以酶活力最高者為100%。結果如圖1，裂褶菌mys005漆酶最適反應溫度為70℃，適宜反應溫度范圍為65~75℃。
2.1.2 mys005漆酶最適反應pH
分別配制pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的醋酸—醋酸鈉緩沖溶液用于測定酶活，以酶活力最高者為100%。結果如圖2，可以看出mys005漆酶最適反應pH為4.5，同時可看出mys005漆酶具有較寬的pH反應范圍，在pH3.5~5.5間，mys005漆酶均能保持比較高的活性，這將大大有利于該漆酶的工業化應用。
2.1.3 mys005漆酶的熱穩定性
將漆酶液在40、50、60、70、80℃下分別保溫30、60、90、120min后測定酶活，以30℃測定的未進行熱處理所測酶活為100%。結果如圖3，可看出mys005漆酶在低于50℃下具有良好的熱穩定性，酶液在40℃保溫2h仍有92%的活力，在50℃保溫2h酶活保存率仍達83%，但當處理溫度達到60℃時，酶活損失較快，保溫2h酶活損失了53%，當處理溫度高于70℃時酶開始迅速失活，高于80℃時，保溫處理30min酶活損失至0。另外，由圖3可見：在40~50℃下，保溫30min，酶活反而增加了20%左右，這一結果與有關報道中熱激對漆酶活有促進作用相一致。綜合考慮漆酶的活性和熱穩定性，確定mys005漆酶的使用溫度不要超過60℃，以40~50℃為最佳。
2.2 mys005漆酶深度處理造紙廢水
2.2.1 mys005漆酶處理廢水最佳處理溫度與最佳處理時間的確定
因為mys005漆酶的適宜反應pH范圍為3.5~5.5，最適使用溫度范圍為40~50℃，故此處初步設定酶處理廢水的pH值為5.0。
取4份200mL的水樣，用稀HCl調水樣pH為5.0，加入漆酶液使反應體系中酶的終濃度為50U/mL，加入介體HBT5mg/L，設定40、45、50、55℃不同溫度進行處理，測定不同處理時間（1、2、3、4、5、6h）后各水樣中木素含量、COD和色度值，計算降解率，以此確定最佳處理溫度與處理時間。結果如圖4~6所示。
從圖4、5、6中可以看出，在pH5.0，處理溫度40~55℃的范圍內，mys005漆酶都能有效降低廢水的木素與COD含量，總的趨勢是：從40~50℃，處理溫度越高，木素、色度與COD的降解率越高，用時越短，其中以50℃處理效果最好，處理4h，木素、色度及COD的降解率分別達到了72.3%、79.1%和59.3%。而當處理溫度為40℃時，由于溫度偏低，降解速率較慢，處理6h后，木素、色度及COD的降解率分別僅為52.7%、55.3%和41.4%；當處理溫度為55℃時，由于超出了酶的最適反應溫度，漆酶失活較快，處理3h后木素、色度及COD的降解率基本已接近最高值，其后雖然延長了處理時間，但降解率增值非常有限，最終處理效果遠低于50℃時的效果。因此，確定mys005漆酶處理廢水的最佳溫度與時間分別為50℃與4h。
2.2.2 mys005漆酶處理廢水最佳pH的確定
取6份200mL的水樣，分別用稀HCl調整水樣pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，加入漆酶液使反應體系中酶的終濃度為50U/mL，加入介體HBT5mg/L,調恒溫水浴為50℃,反應4h后測定各水樣中木素含量、COD和色度值，計算降解率，以此確定處理廢水的最佳pH。結果如圖7所示。
由圖7可看出，從pH4.0~6.5，隨著處理體系pH的上升，廢水中木素、色度與COD的降解率都是先上升后下降，三者都在pH5.0時達到最高值，分別為74.2%、79.9%與59.8%。同時還可看出當處理pH為4.5與5.5時，雖然木素、色度與COD的降解率不如pH5.0時高，但數值相差不大非常接近。綜合考慮因廢水樣的pH為6.7，為了減少調整pH所用酸的加入量，最終選擇處理廢水的最佳pH為5.5。
2.2.3 mys005漆酶處理廢水最佳酶用量的確定
取5份200mL的水樣，用稀HCl調pH為5.5，調恒溫水浴50℃,加入介體HBT5mg/L,加入漆酶液使反應體系中酶的終濃度分別為30、40、50、60、70U/mL，反應4h后測定各水樣中木素含量、COD和色度值，計算降解率，以此確定處理廢水的最佳酶用量。結果如圖8所示。
由圖8可看出，酶用量對廢水處理效果有較大影響，開始隨著漆酶用量的增加，處理效果不斷變好，廢水中木素、色度與COD的降解率持續上升，但當酶用量達到40U/mL時，即使再增加酶的用量，三者的降解率增加卻不再明顯，據此確定漆酶的最佳用量為40U/mL，此時木素、色度與COD的降解率分別為74.1%、78.0%與57.2%。
2.2.4 mys005漆酶處理廢水最佳HBT用量的確定
漆酶介體是一類特殊的小分子物質，它與漆酶共同構成漆酶—介質體系(Laccase-MediatorSystem，LMS)，通過間接提高漆酶的氧化還原電勢和減少漆酶與底物之間的空間阻礙等方式提高漆酶對目標底物的催化氧化效率。HBT(一羥基苯并三氮唑)是一種常見的人工合成的漆酶催化氧化介體物質，它具有N-OH基，做為漆酶介體時會產生氮氧自由基，奪取底物上的氫，形成芐基自由基，使底物化學鍵斷裂，從而提高漆酶的催化效率。有研究證明，白腐菌漆酶—HBT介體體系能對造紙廢水進行有效處理；介體HBT能輔助漆酶降解蒽，漆酶與ABTS、HBT組成的復合介體系統能對菲進行氧化。
取7份200mL的水樣，用稀HCl調pH5.5，調恒溫水浴50℃,加入漆酶液使反應體系中酶的終濃度為40U/mL，分別加入介體HBT0、2、4、5、6、7、8mg/L進行處理，4h后測定各水樣中木素含量、COD和色度值，計算降解率，以此確定處理廢水的最佳HBT添加量。結果如圖9所示。
由圖9可看出，添加介體HBT能大幅提高mys005漆酶處理廢水中木素、色度及COD的降解率，當反應體系不添加HBT時，廢水木素、色度與COD的降解率分別僅為18.7%，23.1%和14.6%；添加介體HBT后，隨著HBT用量的增加三者的降解率呈現出先快速上升而后趨于穩定的趨勢，其中當HBT用量為6mg/L時，處理效果達到最佳，此時木素、色度及COD的降解率分別達到了77.8%，80.7%，60.7%。故此確定介體HBT的最佳用量為6mg/L。
2.2.5 mys005漆酶處理造紙廢水放大驗證實驗
取3份2000mL的水樣，用稀HCl調pH5.5，調恒溫水浴50℃，分別加入漆酶液與介體HBT使各自反應體系中酶與HBT的終濃度分別為40U/mL與6mg/L，開始反應，4h后測定各水樣中木素含量、COD和色度值，計算降解率。結果如表1所示。
由表1放大驗證實驗結果可以看出，mys005漆酶能夠對造紙廠二沉池廢水進行有效的深度處理，在合適的處理條件下，處理廢水的木素、色度及COD的降解率分別達到了77.5%、81.1%和61.1%。
3、小結
（1）裂褶菌mys005漆酶最適反應pH為4.5，且在pH3.5~5.5間酶活穩定性良好；最適反應溫度為70℃；在低于50℃下具有良好的熱穩定性，使用溫度以40~50℃為最佳，不要超過60℃。mys005漆酶與其它真菌漆酶一樣屬于一種酸性酶，但與其它白腐真菌來源的漆酶比較，其具有較寬的pH應用范圍、較高的最適反應溫度與較好的熱穩定性，這都大大便利于其儲存運輸及工業化實際應用。
（2）裂褶菌mys005漆酶能對廢紙造紙廠經生化處理后的二沉池廢水進行有效深度處理，其中處理溫度、處理時間、pH、酶用量及介體用量都會對處理效果產生重要影響；當處理溫度為50℃，pH5.5，酶用量40U/mL，HBT用量6mg/L，處理4h后，廢水的木素、色度與COD的降解率分別達到了77.5%、81.1%和61.1%，表現出了較好的工業應用潛力。（來源：陜西省生物農業研究所，陜西省酶工程技術研究中心，中國科學院西北生物農業中心）
