厭氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation，ANAMMOX)工藝具有高效節能、污泥產量少和無需外加碳源等顯著優勢，適用于高氨氮廢水處理，如垃圾滲濾液、消化廢水和養殖沼液等。但是ANAMMOX工藝的實際應用受限于ANAMMOX菌難以富集，其倍增時間長，細胞產率低。為強化ANAMMOX菌的富集，減少污泥流失，可利用填料的截留作用，構建ANAMMOX生物膜系統，有助于工藝啟動。
ANAMMOX生物膜反應器填料包括：火山巖、沸石、活性炭、聚氨酯海綿、無紡布和聚乙烯填料等。Wang等的研究運行無紡布固定床反應器，經39d完成ANAMMOX啟動，367d達到最大氮處理負荷10.3kg·(m3 ·d)-1，TN去除率90%。王鈞等的研究以聚氨酯海綿作為ANAMMOX生物膜載體，經過73d成功啟動反應器；穩定運行時，總無機氮去除率達到87.97%。
溫度是影響ANAMMOX生物膜工藝運行的重要因素。有研究發現，ANAMMOX菌在10~55℃均有活性，最適溫度30~40℃。曾濤濤的研究考察了火山巖ANAMMOX生物膜反應器常溫下的脫氮效果，結果表明15℃下，進水氨氮ρ(NH4+-N)為190mg·L-1，進水氮容積負荷(NLR)為3.4~4.2kg·(m3 ·d)-1，總氮(TN)去除率為42%~55%；當溫度升高至20~23℃，進水ρ(NH4+-N)為46~78mg·L-1，NLR為2.9~3.2kg·(m3 ·d)-1時，TN去除率可明顯提高至75%左右。
如何實現常低溫下ANAMMOX穩定脫氮是目前ANAMMOX工藝實際應用面臨的問題。本文探討了不同溫度(35~15℃)條件下，無紡布與改性聚氨酯泡沫塑料填料(改性聚氨酯填料)序批式生物膜反應器(sequencebatchbiofilmreactor，SBBR)的脫氮效果和微生物群落變化，以期為ANAMMOX的實際應用提供基礎。
1、材料與方法
1.1 試驗裝置
SBBR試驗裝置如圖1所示。雙層反應器內層直徑80mm，高240mm，有效容積2L；外層與恒溫水浴鍋相連，控制內層反應溫度。反應器用錫紙包裹以避免光照。
兩組反應器分別采用無紡布填料和改性聚氨酯填料，填充比40%。無紡布填料材質為聚丙烯，購自深圳市昌泰無紡布有限公司。將無紡布裁剪為約7cm寬的條狀，然后將無紡布條纏繞在反應器中央的填料棒上，細線扎緊固定。
改性聚氨酯填料為網狀聚氨酯泡沫塑料(購自江蘇艾勤環保科技有限公司)，將其切割為1.0cm3正方體塊備用；采用低溫等離子體技術對填料進行表面改性處理。用細線將填料塊穿起并纏繞固定在反應器中央的填料棒上。
1.2 進水水質
進水成分主要包括： ρ236mg·L-1， ρ(NaNO2)296mg·L-1， ρ(MgSO4 ·7H2 O)300mg·L-1， ρ(NaHCO3)為500mg·L-1， ρ(CaCl2 ·2H2 O)為150mg·L-1， ρ(KH2PO4)為30mg·L-1；微量元素Ⅰ和微量元素Ⅱ各1mL·L-1.采用(1+9)HCl調節pH為7.5~7.8；為保持厭氧條件，進水曝高純N2 15min，使反應器內DO降至0.3mg·L-1以下。
1.3 SBBR工藝啟動與運行
1.3.1 接種污泥
無紡布和改性聚氨酯填料反應器均接種ANAMMOX污泥，接種污泥濃度為4000mg·L-1，進行掛膜。接種污泥取自1m3的SBR反應器，該反應器在25~30℃條件下運行，水力停留時間16h，進水ρ(TN)為500~800mg·L-1，出水ρ(TN)低于50mg·L-1，TN去除率在90%以上。
1.3.2 SBBR工藝啟動
啟動期，控制恒溫35℃，啟動ANAMMOX生物膜反應器。兩反應器的進水NLR為110mg·(L·d)-1，其中ρ(NH4+-N)為50mg·L-1， ρ(NO2--N)為60mg·L-1.試驗運行周期為24h：進水15min，反應時間23h，靜沉30min，排水15min；排水比90%。穩定運行時，無紡布填料反應器的TN去除率長期處于60%~85%；改性聚氨酯填料反應器的TN去除率基本保持在80%以上。
1.3.3 運行
對已經成功啟動并穩定運行一個月的無紡布填料和改性聚氨酯填料反應器進行降溫試驗，共5個階段，溫度梯度設置為35、30、25、20和15℃，每個溫度條件下運行20~25d。溫度變化時，分兩次降溫：第一次降溫3℃，穩定3d后，再降溫2℃至所需溫度。
1.4 分析項目與檢測方法
1.4.1 常規氮指標檢測
每個試驗運行周期結束時，取水樣測定氮指標。NH4+-N、NO2--N和NO3--N均采用國家標準方法檢測，TN為NH4+-N、NO2--N和NO3--N三者之和；pH和DO分別采用便攜式pH計(Jenco，6010M，USA)和便攜式溶解氧儀(Hach，HQ30d，USA)測定。
1.4.2 微生物群落結構和多樣性分析方法
(1)DNA的提取在35、25和15℃穩定運行期間，剪取適量改性聚氨酯生物膜填料，與反應器出水一同置于50mL離心管中，保證填料被浸沒。用多管振蕩儀振蕩10min至生物膜充分脫落。將泥水混合物在轉速3000r·min-1下離心3min，棄去上清液，保留泥樣提取DNA。采用土壤DNA提取試劑盒(OmegaBio-Tek，Inc。，Norcross，GA，USA)提取微生物基因組DNA。
(2)高通量測序對提取出的DNA進行qPCR檢測。對所擴增的16SrRNA中的V3-V4區域，進行小片段基因文庫的構建，并基于IlluminaHiSeq測序平臺對該文庫進行雙末端測序。經過Reads拼接過濾，對所有樣本的有效數據(effectivetags)，以97%的一致性(identity)進行OTUs(operationaltaxonomicunits)聚類，然后對OTUs的序列進行物種注釋豐度分析，揭示樣本的物種組成和群落結構的差異。
2、結果與討論
2.1 不同溫度下ANAMMOX生物膜工藝的脫氮效果
不同溫度條件下，無紡布和改性聚氨酯泡沫塑料填料反應器進出水ρ(NH4+-N)、ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(TN)和TN去除率見圖2，化學計量系數變化如圖3所示。
進水ρ(TN)為110mg·L-1時，在35、30、25、20和15℃運行期間，無紡布填料反應器TN平均去除率分別為71.16%、76.19%、75.15%、72.68%和61.11%，而改性聚氨酯填料反應器TN平均去除率分別為78.71%、80.16%、79.78%、81.75%和75.68%。
在降溫過程中，無紡布填料反應器TN去除率在30℃時達到最大值76.19%，在35~20℃條件下均保持70%以上的TN去除率，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N在1.34~1.45之間，平均ΔNO3--N∶ΔNH4+-N在0.42~0.51之間；降溫至15℃時，TN去除率降低至61.11%，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N降至1.09，低于ANAMMOX反應理論值1.32，平均ΔNO3--N∶ΔNH4+-N降至0.41，但仍高于ANAMMOX反應理論值0.26.化學計量系數與ANAMMOX反應理論值的偏差說明反應器中還存在其他氮轉化的反應。ΔNO2--N∶ΔNH4+-N偏高說明系統中存在反硝化反應，偏低可能是由于硝化過程中的氨氧化或短程反硝化反應；ΔNO3--N∶ΔNH4+-N偏高說明有硝化反應中的亞硝酸鹽氧化過程發生，偏低說明有全程或短程反硝化反應。可以看出，隨著溫度降低，無紡布填料反應器中的硝化反應增強，反硝化反應減弱。改性聚氨酯填料反應器在35~20℃條件下，TN去除率均保持80%左右；降溫至15℃時，TN去除率降至75.68%，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N從1.23~1.41降至1.16，平均ΔNO3--N∶ΔNH4+-N從0.28~0.33降至0.24；降溫過程中，氨氧化和反硝化反應增強，亞硝酸鹽氧化減弱。
這一現象與李祥等的研究結果相似：溫度在26~37℃時，ANAMMOX生物膜反應器氮去除速率在1.51~1.84kg·(m3 ·d)-1之間，變化幅度4.35%，當溫度低于20℃時，去除速率快速下降，尤其當溫度低于15℃時，氮去除速率下降至0.55kg·(m3 ·d)-1，同時出現大量NO2--N積累。宋成康等實驗運行SBR反應器，在20~33℃可穩定ANAMMOX脫氮，其中TN去除負荷穩定在0.4g·(L·d)-1左右；但當溫度為15℃時，出現NO2--N積累。溫度降低導致厭氧氨氧化活性下降和活化能提高，使ANAMMOX脫氮效率下降。
在相同溫度條件下，與無紡布填料反應器相比，改性聚氨酯填料反應器TN去除率更高，化學計量系數更接近ANAMMOX理論值；在降溫過程中，改性聚氨酯填料反應器TN去除率的下降幅度更小。可以看出，改性聚氨酯填料相對于無紡布填料能夠達到更好的脫氮效果，同時對低溫適應能力更強。這可能是因為改性聚氨酯填料的多孔結構更易形成并維持厭氧環境，從而更有利于ANAMMOX反應。因此，改性聚氨酯填料可以作為ANAMMOX生物膜工藝的優選填料；同時改性聚氨酯填料反應器75%以上的TN去除率也說明ANAMMOX生物膜工藝具有常低溫下處理廢水的潛力。
2.2 35、25和15℃條件下改性聚氨酯填料生物膜菌群分析
選取脫氮效果較好的改性聚氨酯填料反應器，分別在35、25和15℃穩定運行期間取3個平行泥樣，檢測其微生物群落的變化。
2.2.1 基于門水平的微生物群落分布
采用MiSeq高通量測序技術分析微生物的特異性DNA片段，根據OTUs序列的物種注釋結果對菌群進行結構組成分析，得到不同溫度條件下改性聚氨酯填料生物膜在門水平上的物種相對豐度如圖4(a)所示。
結果表明，改性聚氨酯填料反應器中的主要微生物菌群包括浮霉菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)等。ANAMMOX菌所屬的浮霉菌門(Planctomycetes)，在35、25和15℃的污泥樣品中分別占33%、26%和41%，相對豐度最高。除此之外，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和綠彎菌門(Chloroflexi)在3個溫度條件下的相對豐度也較高，分別占30%、19%和8%(35℃)，28%、22%和13%(25℃)，26%、10%和6%(15℃)。這幾類相對豐度較高的細菌與ANAMMOX菌之間存在協同和競爭關系，同時得到富集，成為系統中的優勢微生物。
2.2.2 基于屬水平的微生物群落分布
由圖4(b)可知，35℃和25℃下ANAMMOX菌屬CandidatusKuenenia的相對豐度分別為8%和5%，而15℃條件下， CandidatusKuenenia的相對豐度達到16%，說明溫度降低沒有對功能菌的富集產生影響。從35℃到25℃功能菌相對豐度下降可能是因為短期內溫度的下降對ANAMMOX菌活性產生了影響，導致增殖速度減緩，但由于CandidatusKuenenia對20℃以下環境溫度的良好適應性，很快恢復了活性，實現了增殖，在15℃達到相對豐度最大值16%。降溫過程對ANAMMOX菌利用基質的影響大于對增殖的影響，因此，15℃條件下雖然功能菌的豐度達到最大，但是脫氮能力弱于25℃和35℃條件下的脫氮能力。
Pseudomonas、Denitratisoma和Thauera等多個具有反硝化作用的屬也在反應器中共存。其中Pseudomonas和Denitratisoma的相對豐度較高，在不同溫度條件下的相對豐度分別為7.4%和1.9%(35℃)、3.4%和5.4%(25℃)、5.6%和7.4%(15℃)。與CandidatusKuenenia類似，反硝化菌屬Pseudomonas在降溫過程中出現了先適應，后恢復并增殖的現象。 Denitratisoma則比較適應低溫的環境，隨著溫度的降低，相對豐度逐漸升高。系統中還存在硝化細菌，包括AOB屬Nitrosomonas和NOB屬unidentified_Nitrospiraceae。在溫度從35℃降至25℃再到15℃的過程中， Nitrosomonas相對豐度從0.6%上升到1.2%，又降至1.0%； unidentified_Nitrospiraceae 相對豐度則持續下降，從0.61%到0.37%再到0.07%。
降溫過程對不同脫氮細菌的活性影響不同。35、25和15℃條件下，平均ΔNO2--N∶ΔNH4+-N和ΔNO3--N∶ΔNH4+-N分別為1.35和0.33、1.41和0.32、1.16和0.24.降溫至25℃時，ΔNO2--N∶ΔNH4+-N有明顯升高，但是ΔNO3--N∶ΔNH4+-N基本不變，兩個化學計量系數又都高于ANAMMOX理論值，說明此時除ANAMMOX之外還發生亞硝酸鹽氧化和反硝化反應，NOB和反硝化菌(denitrifyingbacteria，DNB)占據較大優勢。繼續降溫至15℃時，ΔNO2--N∶ΔNH4+-N和ΔNO3--N∶ΔNH4+-N均降低且低于ANAMMOX理論值，說明此時發生的脫氮副反應主要為氨氧化和反硝化，AOB和DNB的優勢大于NOB。化學計量系數和物種豐度變化都表明，降溫過程對不同脫氮細菌的代謝和增殖產生了不同影響。
2.2.3微生物群落差異分析
為了比較不同溫度下的微生物群落構成，將所有樣本的物種注釋結果和OTUs的豐度信息合并處理后，進行降維分析，從中發現不同樣本間的差異。
對樣品進行主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)如圖5(a)所示。從中可知，15、25和35℃條件下的生物膜群落構成有顯著差異，且從各組之間的距離可以看出，各組間的差異程度相近。無度量多維標定法(non-metricmulti-dimensionalscaling，NMDS)分析能夠克服PCA線性模型的缺點，更好地反映生態學數據的非線性結構。NMDS分析的結果見圖5(b)，35℃條件下的生物膜菌群組成與其它兩組差異較大，說明溫度顯著影響了生物膜群落結構。
3、結論
(1)在NLR為110mg·(L·d)-1，溫度由35℃逐步降至15℃的過程中，無紡布填料反應器的平均TN去除率先由71.16%(35℃)提升至76.19%(30℃)后又降低至61.11%(15℃)，而改性聚氨酯泡沫塑料填料的平均TN去除率先由78.71%(35℃)提升至81.75%(20℃)后又降低至75.68%(15℃)。
(2)與無紡布填料反應器相比，在相同條件下，改性聚氨酯填料反應器的脫氮效果好于無紡布填料反應器，這說明改性聚氨酯填料反應器系統對溫度波動的適應能力更強，更易在常低溫環境下實現較好的脫氮效果。
(3)高通量測序結果表明，改性聚氨酯填料生物膜主要ANAMMOX菌屬為CandidatusKuenenia，相對豐度分別為8%(35℃)、5%(25℃)和16%(15℃)，說明低溫條件下， CandidatusKuenenia仍會增殖富集。溫度顯著影響了生物膜群落結構。（來源：天津大學環境科學與工程學院，濟南城建集團有限公司）
