煤化工企業(yè)排放的廢水中含有大量的酚、氰油、氨氮、多環(huán)芳香族化合物及含氮氧硫的雜環(huán)化合物等有毒有害物質,綜合廢水中CODCr一般在2000~5000mg·L-1,氨氮在200~500mg·L-1,是典型的含有難降解有機化合物的工業(yè)廢水。據(jù)煤化工行業(yè)調查分析,約70%的機焦廢水未經過脫氮處理直接外排,30%的機焦廢水未經任何處理直接外排。廢水的超標排放對水產、農作物甚至人類健康都構成了極大危害,因此,尋找高效的污水處理方法是當前急待解決的課題。目前,國內外處理煤化工廢水的方法主要有物理法、化學法和生物法。生物法主要通過微生物的新陳代謝作用,將廢物吸收、分解,達到治理污染的目的,因其具有經濟、綠色、安全、有效的特點,得到了廣泛應用。污水中常含有多種性質不同的物質,用單一菌種很難將其徹底降解,在生產中主要以活性污泥法和高效菌劑相結合來處理這一問題。當前,越來越多的國內外學者在污水生物處理過程中引入PCR-DGGE方法,用以研究微生物群落的復雜性,監(jiān)測種群動態(tài),依據(jù)污水處理過程中的群落動態(tài)變化,調節(jié)實際工藝參數(shù),提高污水處理效率。本研究主要對煤化工廢水中篩選出的高效COD降解菌進行生物強化,對菌株進行高效配比研究,制成生物菌劑,研究其在污水處理過程中微生物群落結構的動態(tài)變化及降解特性,以期為提高煤化工廢水處理系統(tǒng)的效率提供科學依據(jù)。
材料
樣品來源
樣品主要采自中國神華煤制油化工有限公司包頭煤化工分公司(污水1)、康達東營環(huán)保水務有限公司(污水2)、中海油天津化工研究設計院(污水3)。采回的樣品置于4℃保存。
培養(yǎng)基
分離培養(yǎng)基(固體)。牛肉膏1.5g,蛋白胨2.5g,KH2PO40.725g,Na2HPO41.136g,MgSO4·7H2O0.2g,CaCl2·2H2O0.02g,NaHCO385mg,2%瓊脂,微量元素Ⅰ,微量元素Ⅱ,蒸餾水1000mL,pH值7.0~8.0。其中,微量元素Ⅰ:FeSO45mg,EDTA5mg;微量元素Ⅱ:EDTA15mg,ZnSO4·7H2O4.3mg,CoCl2·6H2O2.4mg,MnCl26.29mg,CuSO4·5H2O2.5mg,Na2MoO4·2H2O2.2mg,NiCl2·6H2O1.9mg,H3BO30.14mg。將上述配置好的培養(yǎng)基置于0.11MPa,121℃條件下滅菌20min。富集培養(yǎng)基(液體)。C6H12O61.2g,其他成分同分離培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配好后置于0.11MPa,115℃條件下滅菌25min。
復篩培養(yǎng)基。配制模擬污水,COD濃度分別為2560,3040,5280mg·L-1,pH值7.0~8.0(用5%Na2CO3和HCl調pH值)。配好的培養(yǎng)基于0.11MPa,115℃條件下滅菌25min。
COD試劑
Ag2SO4,HgSO4,K2Cr2O7,C6H4(COOH)(COOK),均為分析純,均購自天津市化學試劑研究所。
DGGE試劑
DuRed核酸染料,40%C3H5NO/Bis(37.5∶1),50×TAEBuffer,0%變性液(10%Gel),80%變性液(10%Gel),10%(NH4)2S2O8,1μL·mL-1TEMED。
煤化工廢水COD降解菌篩選
煤化工廢水取樣后富集培養(yǎng),采用稀釋涂布平板法、平板劃線分離法篩選分離COD降解菌。分離純化菌株,4℃斜面保藏。按5%接種量接種至裝有100mL滅菌模擬污水培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中,30℃,150r·min-1振蕩培養(yǎng),48h后更換培養(yǎng)基并逐步提高模擬污水COD濃度,測定降解后模擬廢水COD濃度,計算菌株降解率。
OD降解率測定
采用快速消解分光光度法對化學需氧量進行測定。取待測菌懸液樣品10mL,7000r·min-1離心10min,上清液稀釋至COD量程范圍內,加入到裝有消解液的消解管中,放入HACH消解儀消解,波長600nm測吸光度,超純水作參照,做標準曲線,計算COD降解率。
ρ(COD)=n[k(As-Ab)+a]。(1)
式(1)中,ρ(COD)為水樣COD值,n為水樣稀釋倍數(shù),k為鄰苯二甲酸氫鉀COD校準曲線靈敏度,As為試樣測定的吸光度,Ab為空白試驗測定吸光度,a為校準曲線截距。
M/%=100×(x0-x)/x0。(2)
式(2)中,M為COD降解率,x為反應后COD濃度,x0為初始COD濃度。
生物菌劑的復配研究
將篩選出的5株高效菌株搖瓶培養(yǎng),采用不同方式進行組合,測各組合COD降解率,得最優(yōu)復配組合,配制成菌劑進行生物強化研究。具體聯(lián)系污水寶或參見http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。
生物菌劑的生物強化
取3種煤化工污水進水水樣和氧化段活性污泥。在最優(yōu)降解條件下,將生物菌劑分別接種3種污水培養(yǎng)基,并對高效降解菌的降解特性進行研究。處理1到處理3,分別向污水1到污水3中加入菌劑;處理4到處理6,分別向污水1到污水3中加入菌劑及活性污泥;處理7到處理9,分別向污水1到污水3中加入活性污泥。
每組樣品廢水體積150mL,接菌量統(tǒng)一按照10%設置,投加污泥量統(tǒng)一為75mL。試驗所加活性污泥系生物菌劑強化,出水鏡檢,微生物量較少時,污泥強化完成。每組試驗平行2次。各處理均于30℃,150r·min-1條件下振蕩培養(yǎng),每隔24h測定各處理COD降解率。
PCR
采用OMEGA-SoilDNAKit試劑盒提取污泥DNA,采用LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR試劑盒提取菌株DNA。PCR擴增采用TouchDownPCR模式運行。先對16SrDNA全長序列進行擴增,引物是27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-TACCTTGTTACGACTT-3');然后再對16SrDNA的V3可變區(qū)進行擴增,引物是338f-GC(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和518r(5'-ATACCGCGGCTGCTGG-3')。PCR反應體系(50μL):10×PCRBuffer(Mg2+)5μL,dNTPmixture(各2.5mmol·L-1)4.0μL,引物各1μL(10pmol·μL-1),模板DNA2.5ng,TaKaRaTaq酶(5U·μL-1)0.25μL,滅菌蒸餾水定容至50μL。PCR反應程序:94℃預變性5min;94℃變性1min,50℃退火45s,72℃延伸1min,每個循環(huán)退火溫度降低0.1℃,終至51.5℃,35個循環(huán);72℃最終延伸10min,4℃保存。取2μLPCR反應產物,0.8%瓊脂糖凝膠電泳。對菌落16SrDNA的PCR產物進行純化測序,步確定所分離細菌的分類學地位。
DGGE
采用Bio-Rad公司UniversalMutation檢測系統(tǒng)對神華廢水的PCR擴增產物進行電泳分離。具體步驟:制備垂直膠,確定分離含有核苷酸改變的DNA片段的最佳梯度范圍;制備水平膠,用梯度混合器制備變性劑濃度不同的聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度從膠的上方向下方依次遞增,待膠凝固后,將膠板放入裝有電泳緩沖液的裝置中。經前期條件優(yōu)化,確定DGGE操作條件:樣品/上樣緩沖液為6∶1,上樣15μL,電壓60V,60℃條件下電泳15.5h;DuRed凝膠染色,搖床振蕩30min,超純水沖洗脫色;最后用QuantityOne4.6.2軟件分析DGGE圖譜,得各樣品間相似性矩陣圖,研究微生物多樣性、豐富度、條帶強度分布情況和不同處理階段樣品中微生物相似性等。選擇條帶強度較大的優(yōu)勢菌帶,切膠回收,PCR擴增細菌16SrDNA的V3區(qū),DGGE分析是否為單一菌。
本研究篩選得到5株COD高效降解菌,將菌株經復配、污泥強化,得到強化菌劑,對3種煤化工廢水COD的去除率均達89.3%以上,抗沖擊負荷能力顯著增強,菌劑在投加污水后經過適應期后一直占據(jù)優(yōu)勢地位,且對高濃度COD污水的處理效果也很理想,表明該菌劑具有發(fā)展成為商品菌劑的潛力。開發(fā)該商品菌劑有利于節(jié)約污水處理成本,對污水處理系統(tǒng)的快速啟動也具有積極意義。