厭氧污泥是多種厭氧微生物形成的復雜聚集體，不同處理工藝內污泥中微生物群落的研究成為廢水處理反應器的研究熱點. 反應器內微生物的群落結構的變化及生態演替受生態因子如溫度[1, 2]、 pH[2]、 氧化還原電位[3]、 反應器進水成分[4]、 進水碳硫比[5,6]等的影響; 同時，微生物種群的分布[10]、 不同微生物種群之間存在的協同[11]和競爭制約[12]生態學效應等，直接影響著反應器的處理效果.
厭氧污泥的馴化是UASB 等厭氧反應器運行的關鍵，對厭氧污泥馴化過程中微生物生態結構的變化及群落演替的研究具有重要的意義. 近年來不依賴純培養的分子生物學的方法發展迅速，也得到廣泛的應用[13]，其中利用PCR-DGGE來研究未培養或不能培養的微生物，能夠提供群落中優勢種類信息和同時分析多個樣品，適合于監測或調查種群的時空變化，自從1993年被Muyzer等[14]引入微生物生態學研究以來，已廣泛應用于分析活性污泥[15]、 生物濾池[16]、 生物膜[17]、 土壤[18]、 底泥[19]、 水體[20]等各種環境中生物多樣性、 種群演替等方面. 本研究采用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術，通過不依賴分離培養的核酸信息對處理高濃度硫酸鹽有機廢水UASB反應器污泥馴化過程中微生物群落的變化進行了分析，以期為工藝優化和揭示厭氧污泥中硫酸鹽生物處理機制提供科學依據.
1 材料與方法
1.1 硫酸鹽還原反應器污泥的馴化
采用UASB為硫酸鹽還原反應器，容積為19.4 L. 接種污泥來源于某污水處理廠ABR的厭氧污泥和河涌底泥的混合污泥，以人工配水進行污泥馴化. 配水成分包含葡萄糖5 g ·L-1，酵母抽提物0.2 g ·L-1，Na2SO4 1.7 g ·L-1，MgSO4 0.03 g ·L-1，CaCl2 0.01 g ·L-1，KH2PO4 0.25 g ·L-1，NH4Cl 0.1 g ·L-1，NaHCO3 2 g ·L-1，(NH4)2CO3 0.1 g ·L-1，進水pH約為7.0.
反應器污泥馴化采用固定進水濃度，逐漸縮短水力停留時間的方法以提高反應器硫酸鹽負荷. 整個馴化過程歷時240 d，按水力停留時間的不同分為4個馴化階段，其中第0~150 d為第1階段，水力停留時間為80 h; 第150~180 d為第2階段，水力停留時間為60 h; 第180~210 d為第3階段，水力停留時間為48 h; 第210~240 d為第4階段，水力停留時間為24 h.
1.2 采樣
本研究共采集污泥樣品7個，自反應器污泥馴化的4個不同階段，分別于馴化開始的第30、 60、 120、 150、 180、 210和240 d采用滅菌的離心管采集污泥樣品，樣品依次標記為A、 B、 C、 D、 E、 F和G. 所采集的樣品直接用于基因組DNA的提取或凍存-80℃冰箱中待用，并測定MLVSS. 此外，定期采集反應器進出水水樣，測定其中COD和硫酸鹽含量的變化.
1.3 理化分析方法
MLVSS、 COD、 硫酸鹽采用文獻[21]的方法進行測定.
1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析微生物群落變化 1.4.1 細菌基因組總DNA的提取與純化
取5 g污泥樣品，采用Zhou等[22]的方法進行總DNA提取. 所得DNA初提液采用天根公司的DNA純化試劑盒進行純化.
1.4.2 PCR擴增及變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析
以純化后的細菌基因組總DNA為模板，采用細菌通用引物27F與1492R擴增以得到全長16S rDNA; 再以該擴增產物為模板，采用對大多數細菌和古生菌的16S rDNA基因V3區具有特異性的引物對GC-341F和534R[23]進行擴增.
PCR反應在MyCycler (Bio-Rad)上進行，50 μL反應體系為50 ng的模板、 20 pmol正反向引物、 200 μmol ·L-1 dNTP、 5 μL的10×PCR buffer (不含MgCl2)、 1.5 mmol ·L-1的MgCl2、 1 U的ExTaq DNA聚合酶和適量的雙蒸水. 反應程序: 94℃ 4 min; 94℃ 45 s，55℃ 1 min，72℃ 45 s，30次循環; 72℃ 10 min.
采用D-code基因突變檢測系統(Bio-Rad Laboratories Inc.USA)對 PCR 反應產物進行DGGE分離. 采用8%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑范圍為35%~55%(100%的變性劑定義為7 mol ·L-1尿素和40%去離子甲酰胺)，在1×TAE(40 mmol ·L-1 Tris，20 mmol ·L-1乙酸，1 mmol ·L-1 EDTA，pH 7.4)中，60℃、150 V電泳6 h，用Goldenview染液染色，Bio-Rad凝膠成像系統觀察并拍照.
采用Quantity One軟件對DGGE圖譜進行分析，對各泳道的條帶數目、 位置及亮度，不同樣品間細菌群落相似度用Dice系數計算，生成相似度矩陣.根據圖譜中不同條帶的光密度值,采用公式(1)和(2)計算微生物群落的Shannon-Wiener指數.
式中，ai為泳道中i條帶的光密度值，pi為i條帶光密度值占該泳道中所有條帶總光密度值的百分數，H為微生物群落的Shannon-Wiener指數.
采用SPSS軟件對馴化污泥化過程中反應器COD及硫酸鹽去除效率、 微生物群落Shannon-Wiener指數等參數的變化進行相關性分析，選擇Pearson相關分析選項，軟件自動完成.
1.4.3 切膠測序及系統發育分析
對DGGE圖譜上的優勢條帶進行切膠回收，以V3區引物(不帶GC夾)采用相同程序進行PCR擴增，擴增產物經純化后采用PGM-T載體克隆至E.coli Top10后送交上海生物工程技術公司測序. 將測序結果提交NCBI數據庫Blast搜索出相似性高的序列，利用Clustal X軟件進行多序列比對，通過Mega 5構建系統發育樹.
2 結果與討論
2.1 微生物群落多樣性及反應器處理效率變化
為考察厭氧污泥馴化過程中群落多樣性的變化情況，采集反應器馴化不同時期的污泥樣品，對其進行微生物總DNA提取，并采用試劑盒對DNA初提液進行純化，并以此為模板，采用巢式擴增，先用引物對27F/1492R 擴增得到污泥中微生物全長16S rDNA，再以此為模板，采用引物對341/534擴增得到微生物16S rDNA V3可變區基因，通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)進行分析，不同泳道分別代表反應器馴化不同天數時所取反應器泥樣. 污泥馴化不同時期微生物群落變性梯度凝膠電泳圖譜分析如圖 1所示. 結果表明，重復電泳的結果非常相似，重復間的相似性達99%，7個不同時期的污泥樣品中微生物群落電泳圖譜中條帶的位置和數量不同，電泳條帶呈現較明顯的變化,顯示反應器污泥馴化的不同時期，隨著反應器的污泥馴化，污泥樣品DGGE電泳圖譜中條帶數量增多，微生物群落結構和種群數量存在明顯的演替過程. 既有一些相同的微生物種群，如條帶1、 4、 7、 8、 9等，雖然亮度有所變化，但存在于整個馴化過程中; 也有一些種群(條帶)逐漸消亡或者減弱的,而一些種群(條帶)逐級出現或增強; 也有一些樣品各自獨有的種群，如第150 d樣品的條帶3; 另外還有相鄰階段共有的條帶，如第180 d和第210 d樣品的條帶13.
圖 1 污泥馴化不同階段的變性梯度凝膠電泳(DGGE)圖譜
采用凝膠分析軟件Quantity One 對反應器馴化不同時期污泥樣品電泳圖譜相似度進行分析，分析結果見表 1. 結果顯示，反應器馴化相鄰階段時期，污泥中微生物群落相似度均在30%以上，其中樣品D與樣品E，以及樣品F與樣品G之間相似度均為57%左右，表明反應器馴化的第150~180 d、 第210~240 d這2個階段污泥中微生物群落變化較小. 而從不同時期反應器處理效率(圖 2)可知，恰好這2個階段是反應器硫酸鹽處理效率高效和穩定的時期，去除率達90%~99%.
表 1 反應器馴化不同時期污泥樣品DGGE圖譜相似度
為了解馴化過程中反應器處理效率與污泥中微生物群落多樣性指數變化的關系，采用SPSS軟件，對反應器馴化時間、 COD與硫酸鹽負荷及其去除效果、 污泥濃度、 污泥中微生物群落多樣性指數進行相關性分析，結果見表 2.
結合圖 2和表 2來分析，可見反應器硫酸鹽及COD去除率與馴化時間、污泥濃度、污泥中微生物群落多樣性指數呈明顯的正相關. 王愛杰等[24]在產酸脫硫反應器研究中發現，在不同的群落演替階段,每個種群的代謝活性有一定差別,表現為COD 去除率、 SO2-4去除率的差異. 而本研究中隨著污泥馴化的進行，微生物群落生物多樣性得以提高，當微生物群落Shannon指數大于3.45、 污泥濃度大于40 g ·L-1時，硫酸鹽去除率穩定在95%左右，這說明反應器污泥馴化成熟，處理系統中各菌群處于良好的協同狀態.
圖 2 污泥馴化不同時期反應器處理效率及微生物群落多樣性變化的關系
表 2 各參數相關性分析 1)
2.2 污泥中微生物系統發育分析
為了進一步分析微生物群落結構中的優勢菌株和污泥中微生物的系統發育,對電泳圖譜中較亮條帶進行切割回收后，采用T載體克隆并測序進行系統發育分析見圖 3.
圖 3 基于DGGE條帶16S rDNA序列的不同泥樣細菌系統發育樹
結合圖 1和圖 3可知，反應器污泥中微生物群落中主要包含4大類群，其中Firmicutes占總數的50.0%,Proteobacteria占總數的28.6%，Deinococcus-Thermus占總數的14.3%,Chloroflexi占總數的7.1%.
污泥馴化過程中出現大量屬于Firmicutes的發酵產酸菌，如條帶1、4、7、8、9、10、14. 發酵產酸細菌能夠將大分子的底物(如蔗糖、 葡萄糖和果糖等)轉化為乙酸、乙醇、氫氣、甲醇和甲酸等易被SRB利用的物質;在為SRB提供底物,緩沖堿度變化,維持系統適合的代謝環境等方面起著決定作用[24]. 本研究中的Firmicutes細菌均屬于梭菌屬Clostridium sp.，其中大部分菌群如條帶1、4、7、8、9所代表的菌群在反應器馴化的4個階段中均可監測到，為微生物群落中的優勢菌屬. Clostridium嚴格厭氧，能夠產NH3H2S、H2,具有固氮、 發酵糖類產乙酸乳酸等功能[25]. Kaksonen等[26]在硫酸鹽還原反應器中曾分離得到Clostridium 菌株. 此外，任南琪等[27]在硫酸鹽還原反應器中也監測到Clostridium 的某些菌種隨硫酸鹽去除率的升高得以富集，在反應器中占優勢. 有研究表明，隨著不同種類的Clostridium屬細菌的出現，其代謝產生大量發酵終產物作為硫酸鹽還原過程的作用底物，從而影響硫酸鹽還原菌群的豐度變化[28]，由此造成硫酸鹽還原菌群與Clostridia菌群呈平行的動態變化[29]. 本研究中Clostridium細菌在所監測的微生物群落中所占百分數為50.0%，并且隨著反應器硫酸鹽負荷的提高，屬于該屬的某些種類細菌相繼出現或消亡，由此推測該屬菌群在本反應器的硫酸鹽還原過程中起著重要的作用.
Chloroflexi 、Geobacter、Geopsychrobacter是廢水厭氧處理系統中的常見菌[30]，在本研究的污泥中也存在. 條帶3包含的序列屬于Chloroflexi，在反應器污泥馴化過程中(第150 d)曾成為優勢菌群，但后來隨著反應器污泥的進一步馴化而消失. 顆粒污泥中經常監測到Chloroflexi 細菌，Roest 等[31]認為污泥中的Chloroflexi細菌可能直接或間接參與丁酸鹽的降解. 條帶5包含的序列屬于變形菌門中的Geobacter sp.，自反應器馴化的第30 d后開始成為反應器中的優勢菌群之一，馴化至第150 d后，條帶亮度增強. Geobacter為厭氧菌，能夠氧化有機物為CO2，以鐵氧化物作為電子受體，被用于去除廢水中有機及金屬污染物[32]. 近年來在環境修復的研究中也發現該類菌的存在[33]. 條帶12、 13包含的序列屬于Geopsychrobacter sp.,其中，條帶12在第60 d條亮度最強，在馴化的污泥過程中亮度減弱或消失，條帶13在污泥馴化的第150~210 d內占優勢，該屬的某些細菌具有還原元素硫及Mn(Ⅳ),并氧化乙酸鹽、 琥珀酸鹽、 丙酸鹽的功能[34].
本研究在污泥馴化的第1及第2階段(第0~180 d)硫酸鹽還原菌屬均未占優勢，但在馴化的最后2個階段(第210～240 d)監測到Desulfovibrio sp. (條帶11)占優勢. Desulfovibrio sp.是革蘭氏陰性菌，為快速生長的硫酸鹽還原菌，能夠部分氧化某些有機物為乙酸鹽和CO2 [35]，并利用氫為能源，以H+為電子受體，還原硫酸鹽為硫化物[36]. 本研究中僅監測到這一類硫酸鹽還原菌群，是由于人工配水馴化，底物單一的原因. 此外，Desulfovibrio占優勢的2個階段，反應器硫酸鹽去除效率最高，為95%以上，可見Desulfovibrio 的數量與硫酸鹽去除率間存在明顯的正相關，因此該菌屬的數量與活性是影響反應器硫酸鹽去除效率的重要因素. 這些結果與任南琪等[27]的研究結果一致.
此外，條帶2、 6所包含的序列屬于異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)，它們在微生物生態系統中所起的作用尚不明確，還有待進一步探索.具體參見污水寶商城資料或http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。
3 結論
(1) 反應器污泥馴化過程中，微生物群落生物多樣性與反應器硫酸鹽及COD去除率呈明顯的正相關關系. 當微生物群落Shannon指數大于3.45、 污泥濃度大于40 g ·L-1時，硫酸鹽去除率穩定在95%左右，處理系統中各菌群處于良好的協同狀態.
(2)反應器污泥中微生物群落主要包含Firmicutes、 Proteobacteria、Deinococcus-Thermus、Chloroflexi 4大類群,分別占總數的50.0%、28.6%、 14.3%和7.1%. 隨著反應器污泥的馴化，污泥的微生物群落結構和種群數量存在明顯的演替過程. 其中厭氧發酵細菌Clostridium sp.在馴化全過程中均占優勢，但優勢菌群的種類發生變化; 厭氧細菌Chloroflexi sp.在反應器馴化污泥第150 d曾成為優勢菌群，但后來隨著反應器污泥的進一步馴化而消失; 厭氧細菌Geobacter sp. 自反應器馴化的第30 d后開始成為反應器中的優勢菌群之一，馴化至第150 d后，成為優勢菌群; 厭氧細菌Geopsychrobacter sp.在污泥馴化過程中相繼出現或消亡; Desulfovibrio sp.在污泥馴化的最后2個階段占優勢.
