發光細菌法作為一種靈敏、 快速、 廉價的生物檢測手段，普遍應用于生物毒性的測定. 發光細菌受到有害物質干擾時，發光代謝受到影響，根據有害物質的種類與濃度不同，菌體發光強弱程度不同，據此以監測有害物質的毒性[1]. 早在20世紀30年代，發光細菌首先用于快速評價藥物的毒性作用[2]. 隨著對發光細菌的認識和理解的深入，這種毒性評價技術逐漸發展成熟，已成功用于研究苯酚衍生物和硝基苯[3]、 五氯酚鈉[4]、 水環境中金屬[1]、 土壤中有機污染物2,4,6-三硝基甲苯[5]、 農藥[6]等多種物質的毒性，該法對生物毒性效應具有很好的指示作用，現已成為一種國際通用的標準毒性評價手段. 早期研究發現，污染物的濃度與發光細菌的發光度呈一定的線性關系，但隨著科學的發展，越來越多的研究顯示，利用Sigmoidal模型、 Weibull 或Logit 模型等擬合出的“S”型曲線能夠有效地描述污染物的毒性，較線性擬合更加符合毒物與發光細菌作用的劑量-效應關系[7, 8]. 目前，國內對應用發光細菌法評價工業廢水毒性的報道較少. 張秀君等[9]在對造紙、 冶煉、 化工、 采礦等行業的廢水進行急性毒性監測時，指出發光細菌法可以較好地評價工業廢水的毒性. 胡莉莉[10]利用發光細菌試驗測試了122種工業廢水得出結論，對于COD較高而成分未知的有機廢水，利用發光細菌檢測方法可以較好地評價其對生物的毒害效應. 那廣水等[11]利用發光細菌法評價了排污口污水中總有機污染物的毒性作用后，明確指出，該法對工業廢水中的總有機污染物毒性的評價是準確和全面的. 而對于制藥廢水利用發光細菌法進行綜合生物毒性評價，國內的研究更為少見. 李專等[12]曾利用淡水發光菌對多個制藥廠排水進行綜合生物毒性研究，給出了毒性強弱程度排序，并分析了不同制藥廠排水與水體COD之間的關系，指出不同制藥廠排水對發光細菌的毒性與水體COD并無相關性. 劉銳等[13]利用明亮發光桿菌T3小種對維生素制藥各工段排水進行了毒性評價， 得到相應水樣的半數抑制濃度，并對TOC與水樣毒性進行相關分析，最終給出了排水處理工藝的優化建議. 季軍遠等[14]利用明亮發光桿菌T3小種對制藥廢水中可能包含的4類抗生素和厭氧消化中間產物進行了毒性評價，得到氨芐青霉素、 林可霉素、 卡那霉素和環丙沙星的半數抑制濃度依次為3.99、 5.11、 4.32和5.63 g ·L-1，厭氧消化中間產物乙醇、 乙酸、 丙酸、 丁酸的半數抑制濃度依次為19.40、 20.71、 10.47和12.17 g ·L-1. 一些發達國家從20世紀70年代起，已經開始利用發光細菌等生物，對排放廢水進行生物毒性評價，并制定相關的排放標準[15]. 在此期間，美國結合半數抑制濃度EC50，提出了廢水急性毒性的評價指標單位TUa(acute toxic unit)[16]，TUa與EC50在數值上的關系為TUa=100/EC50. 目前，發光細菌法已成功應用于醫院[17]、 電鍍[18]等行業的廢水毒性評價. 歐洲在2000年前后提出了最低無效應稀釋度LID(lowest ineflective dilution)[19]，規定為沒有觀察到抑制作用的最大濃度組的稀釋倍數值，或者是只觀察到不超過特定測試方法變異性效應的最大濃度組的稀釋倍數值. 它是用于排放廢水管理的毒理學新概念，直觀地描述了有毒的廢水對受試生物不產生毒害效應所需的稀釋倍數. 本研究利用發光細菌急性毒性評價制藥廢水在污水處理過程中的毒性削減過程，結合EC50、 LID和TUa，評價不同處理階段廢水的生物毒性，以期為利用生物毒性評價制藥工業廢水提供理論依據.
1 材料與方法
1.1 水樣來源
本試驗水樣來自某抗生素制藥廠2012年8月的廢水處理站廢水，該廠廢水font>的處理工藝為接觸氧化法. 選取5個采樣點分別為： ①地下調節池、 ②地上調節池、 ③中間沉淀池、 ④二級沉淀池和⑤總出水排放口，采集廢水處理工藝構筑物中的廢水. 廢水處理工藝流程和采樣點如圖 1所示.
圖 1 各采樣點在處理工藝中的分布情況
1.2 發光細菌
明亮發光桿菌T3小種(Photobacterium phosphorem T3 spp.)，屬于海洋發光細菌，購自中國科學院南京土壤研究所.
1.3 主要試劑與儀器
氯化鈉(NaCl，化學純).
冰點滲透壓儀，DXY-2型生物毒性測定儀，真空過濾泵，玻璃濾器，保溫箱，4 L玻璃膜口瓶，封口膜，玻璃纖維素膜等.
1.4 樣品處理
水樣經玻璃纖維素膜，去除大顆粒雜質. 按照1.45 g ·(100 mL)-1廢水比例添加氯化鈉，相當于3 g ·(100 mL)-1氯化鈉溶液的冰點滲透壓，以保證明亮發光桿菌T3小種細胞所需的滲透壓，避免滲透壓對試驗結果產生影響.
1.5 發光細菌試驗
利用明亮發光桿菌凍干粉進行廢水不同樣品不同濃度的急性毒性研究. 樣品濃度設置參照ISO 11348-3[20]的方法交叉等級稀釋，設置2個平行. 操作步驟嚴格參照《水質-急性毒性的測定-發光細菌法》(GB/T 15441-1995)進行，并根據要求，利用HgCl2對本研究所用發光細菌進行敏感性評價[21].
根據空白樣品的發光量L0和樣品的發光量Li，計算樣品的相對發光度Ii，即：
利用Origin 7.5軟件繪制樣品濃度與發光細菌相對發光度的關系曲線圖.
1.6 毒性評價
Coleman等[22]根據樣品濃度和發光細菌的發光度值EC50之間的關系，將受試物毒性進行分級，如表 1所示.
表 1 受試物毒性等級
表 2 工業廢水生物毒性分級
2 結果與討論
2.1 廢水水質分析
根據該廢水處理廠常年檢測結果的統計數據，合成廢水的COD值較高，平均為26 721 mg ·L-1，流量較小，為39 m3 ·d-1，氨氮含量較高，為1 760 mg ·L-1; 綜合廢水COD值較低，平均為4 006 mg ·L-1，流量較大，為1 833 m3 ·d-1，氨氮含量較低，為21 mg ·L-1. 該廢水處理廠水中含有大量的抗生素和有機物，具有生物降解難、 有機物含量高等特點. 本研究為隨機采樣，采樣點廢水pH、 COD等常規理化指標測定結果如表 3所示.
表 3 采樣點廢水的理化數據 1)
2.2 地下調節池水樣分析
地下調節池是廢水處理工藝的第一段工藝，調節制藥廠瞬時綜合廢水的流量，即1號水樣. 如圖 2所示，此處廢水毒性較大，濃度為100%時，發光細菌的相對發光度為19.41%. 廢水毒性作用范圍較寬，濃度稀釋至0.07%時，相對發光度為103.90%. 通過計算可知，該段廢水的EC50=3.44%，TUa=29，LID=625. 該工藝的廢水主要是制藥廢水，其中抗生素含量較高，對發光細菌的毒性較大，故得出的最低無效應稀釋度較大. 本研究所用菌種HgCl2的EC50=0.10 mg ·L-1，符合國標中試驗菌種的敏感性要求[21].
圖 2 1號水樣不同濃度的發光細菌相對發光度
2.3 地上調節池水樣分析
地上調節池是廢水處理工藝的第二段流程，收納了經過地下調節池處理并沉淀后的廢水和一部分合成廢水，即2號水樣. 如圖 3所示，該處的廢水毒性較1號水樣毒性更大，廢水濃度為100%時，相對發光度僅為10.78%. 毒性作用范圍較1號水樣更加寬泛，在濃度為0.03%時，相對發光度為101.30%. 通過計算可知，該段廢水EC50=2.46%，TUa=41，LID=244. 比較1號和2號水樣的毒性數據可知，根據EC50鑒別廢水的毒性，2號水樣的生物毒性略高于1號，與理化指標中COD反映的現象一致. 由于地上調節池中混入了合成廢水，污染物成分更加復雜，有可能產生聯合毒性效應，對發光細菌的影響更為明顯，毒性抑制作用更大. 從圖 3中亦可看出，此段廢水在0.07%和0.16%濃度點，發光細菌的相對發光度均明顯高出最低濃度. 該現象推測是在一定的低濃度范圍內，毒性物質與發光細菌相互作用時，具有一定的刺激效應，促使發光量增大，即低劑量興奮作用; 或者是由于廢水中含有一定的營養物質，在毒性很低的情況下，營養物質促進了發光細菌的活動，導致發光亮增大. 在唐景春等[25]的研究中也出現了相同的情況，他們認為可能是由于一些污水中含有可被微生物利用的營養物質，這些物質的存在促進了發光菌的發光活性. 對于這種促進作用，目前沒有研究給出具體的、 確切的解釋，有待日后繼續深入探討.
圖 3 2號水樣不同濃度的發光細菌相對發光度
2.4 中間沉淀池水樣分析
地上調節池的廢水經過一級好氧處理后進入中間沉淀池，即3號水樣. 如圖 4所示，在濃度為100%時，發光細菌的相對發光度已經高于50%，達到66.60%. 此時的水樣EC50>100%，但由于仍具有一定的毒性，故可獲得最低無效應稀釋度，即LID=10. 經過好氧生物處理，3號水樣的COD去除率達到93%，其中的有機污染物被微生物氧化分解，水質的毒性有了大幅度的削減，對發光細菌的抑制作用已經明顯減弱，相對發光度明顯高于1、 2號，但并不是完全無毒性. 該沉淀池的好氧處理過程雖然能處理部分懸浮物質，但殘留的有機污染物仍然對發光細菌造成了一定的抑制作用[26].
圖 4 3號水樣不同濃度的發光細菌相對發光度
2.5 二級沉淀池水樣分析
中間沉淀池的廢水經過A/O池處理后，進入二級沉淀池，即4號水樣. 如圖 5所示，該水樣作用的發光細菌相對發光度均在100%附近，且絕大部分高于100%. 說明此段的廢水對發光細菌已無明顯的抑制效應. 因此，4號水樣對發光細菌作用的EC50>100%，LID=1，且100%濃度廢水的發光細菌相對發光度為109.90%. A/O法結合前段缺氧和后段好氧處理，降解有機污染物，并具有一定的脫氮除磷功能，提高污水的可生化性及氧化效率，結合反硝化作用完成C、 N、 O在生態中的循環，實現污水無害化處理. 因此，從LID的測試結果可以看出，經過A/O工藝處理，完全去除了水質對發光細菌的毒性抑制作用.
圖 5 4號水樣不同濃度的發光細菌相對發光度
2.6 最終排出口水樣分析
二級沉淀池的水經過絮凝沉淀池的再沉淀作用后，最終從污水處理廠的排水口排出，即5號水樣. 如圖 6所示，該水樣對發光細菌的影響保持與4號水樣相同的趨勢， 5號水樣的EC50>100%，LID=1. 從數據和圖形可見，100%濃度下的發光細菌相對發光度為103.70%，明顯高于《混裝制劑類制藥工業水污染物排放標準》(GB 21908-2008)中規定的發光細菌急性毒性標準限值，即HgCl2濃度為0.07 mg ·L-1時相對應的發光細菌相對發光度75.25%，故總出水排放口水樣已經達到排放標準[27].
圖 6 5號水樣不同濃度的發光細菌相對發光度
2.7 水樣COD值與發光細菌相對發光度的關系
對各采樣點水樣的COD值與100%濃度下對應的發光細菌相對發光度進行比較. 相對發光度以I表示. 具體情況見表 4.
表 4 廢水COD值與發光細菌的相對發光度
從表4中可知，在一定情況下，隨著COD的降低，發光細菌的相對發光度逐漸升高. 對兩組數據進行擬合，發現相對發光度與COD值、 lg(COD)具有一定的線性關系，擬合公式分別為式(2)和式(3)：
式中，Y為發光細菌相對發光度，X1和X2分別為COD和lg(COD)值，公式(2) R2=0.869 6，公式(3) R2=0.941 2. 根據R2值可知，相對發光度與lg(COD)值的線性關系較好.
3 問題與建議
(1)在廢水處理工藝中增加生物毒性指標，對監測廢水中的污染物毒性具有良好的指示作用，但是目前我國對相關領域的研究和應用還不能構成體系.
(2)發光細菌在指示工業廢水毒性時，受廢水中物質成分的影響. 對于發光量不被抑制反被促進的現象還有待進一步研究.
(3)本研究僅針對于該廠夏季廢水處理工藝效果，鑒于季節差異對該廢水處理工藝的影響較大，故其他季節的廢水處理能力有待進一步研究.具體參見污水寶商城資料或http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。
4 結論
(1)污水處理工藝節點所取1～5號水樣對發光細菌的毒性逐漸減弱，最終排出口對發光細菌無可見毒性抑制作用，現有廢水處理工藝在夏季能夠有效地降低制藥廢水的生物毒性.
(2)發光細菌的相對發光度與水樣lg(COD)值之間線性相關性較好，對同一生產階段制藥廢水COD的變化具有一定的指示作用.
(3)在較低的濃度范圍內，廢水對發光細菌的發光反應具有促進作用，增大發光細菌的相對發光度.
