1 引言

　　異化鐵還原，又稱鐵呼吸，是由特定微生物驅動的酶促反應，鐵還原菌則是實現這一過程的主體.早在20世紀初人們就相繼發現了Fe(Ⅲ)還原現象(Harder et al., 1919; Allison et al., 1942; Lovely et al., 1988)，近年來，隨著人們對異化Fe(Ⅲ)還原過程認識的不斷深入，Fe(Ⅲ)的微生物異化還原過程在環境污染治理與修復領域的應用也越來越受到重視.研究表明，微生物異化Fe(Ⅲ)還原過程可耦聯有機物尤其是難降解有機物(如氯代有機物、偶氮染料、石化類有機物)的氧化降解、有毒重金屬離子(鈾、鉻、砷等)的礦化及參與自然界中的氮磷循環(Li et al., 2010; Sabrina et al., 2007).同時，異化Fe(Ⅲ)還原微生物即鐵還原菌(Iron-reducing bacteria，IRB)也是活性污泥的重要組成部分，該類微生物可占到活性污泥微生物總量的3%左右(Nielsen et al., 2002).因此，強化污水處理系統中微生物異化Fe(Ⅲ)還原過程，對于提高污水處理系統對難降解有機物的降解效率，以及改善污水中脫氮除磷效果等有著重要的意義.而研究不同形式的Fe(Ⅲ)對活性污泥微生物異化還原過程的影響，尋找一種廉價、易被微生物利用的Fe(Ⅲ)源，無疑是實現這一過程的關鍵.Ivanov等(2010)利用鐵礦石與Fe(OH)3對環境中雌激素的降解效果進行了經濟性比較;Stabnikov等(2004)采用濕地鐵礦石、富鐵粘土產生Fe(Ⅱ)達到除磷的目的;欒富波等(2009)研究了針鐵礦、赤鐵礦、磁鐵礦和鋼渣等鐵氧化物表面結合鐵系統對硝基苯的還原轉化能力.但目前大多研究主要關注于鐵還原菌純菌的應用，且使用條件苛刻，而研究厭氧條件下活性污泥微生物的異化還原過程，并將其應用于污水脫氮方面的文獻還鮮見報道.

　　因此，本研究采用廉價的氧化鐵皮、青礦和紅礦與Fe(OH)3作為Fe(Ⅲ)源，通過平行對比試驗考察了不同形式Fe(Ⅲ)對活性污泥異化鐵還原能力及體系中不同形式氮變化的影響，并對微生物介導的多組分交互作用機制，尤其是微生物-Fe-N耦合機制進行初步探討，旨在為投資少、運行費用低、脫氮效果穩定的城市污水脫氮工藝的開發提供一種新的思路.

　　2 材料與方法

　　2.1.1 材料的制備

　　實驗選用氧化鐵皮、青礦、紅礦作為Fe(Ⅲ)源，并以常用的Fe(Ⅲ)源——Fe(OH)3作為對比.實驗用Fe(OH)3懸液(含鐵量為5.188 g · L-1)采用人工合成的方法配制，即用0.4 mmol · L-1的FeCl3和0.5 mol · L-1 NaOH溶液慢速中和沉淀，得到的紅褐色沉淀用去離子水反復洗滌，重復6次至完全去除懸液中的氯離子和鈉離子為止(Lovley et al., 1986).采用JSM-5600LV低真空掃描電子顯微鏡X射線能量色散譜儀對氧化鐵皮、青礦及紅礦進行表面形貌觀察(圖 1)及組成分析(表 1)，可見，氧化鐵皮表面致密，而青礦和紅礦粒 度分散，呈較為密實的穩定結構形式，含鐵量(質量分數)依次約為71.3%、58.6%、36.2%.由于實驗采用的氧化鐵皮具有一定的延展性，較難破碎，因此，投加前將氧化鐵皮剪碎至粒徑為2.0~3.0 mm的條狀，而兩種礦石均經粉碎、研磨、篩分，選擇80目粒徑進行試驗.

　　圖 1 初始不同Fe(Ⅲ)的表面形貌觀察圖(a.氧化鐵皮，b.青礦，c.紅礦)

　　表1 不同Fe(Ⅲ)來源及組成成分比較

　　2.1.2 接種污泥與實驗用污水

　　接種污泥取自本實驗室中裝填有海綿鐵-AT-PVF復合填料的SBBR反應器，有效容積為0.36 m3(李杰等，2010).該反應器已穩定運行1年多，污泥具有較高的微生物活性.將該接種污泥用去離子水反復清洗、離心，以降低污泥中Fe(Ⅱ)、NH+4-N，完全去除NO-2-N、NO-3-N離子，避免對實驗產生干擾.最終測定揮發性懸浮固體(MLVSS)與懸浮固體(MLSS)的比值為0.6，pH值為7.2，所含Fe(Ⅱ)和Fe(tot)含量分別為14.83、200.55 mg · L-1，未檢測出NO-2-N、NO-3-N.其中，反應體系內污泥接種量為1.41 g · L-1.

　　采用人工配水，配水成分為：10 mL葡萄糖(10 mmol · L-1)、5 mL氯化銨(5 g · L-1)及25 mmol · L-1的磷酸鹽緩沖液(KH2PO4與K2HPO4的摩爾比為0.5809)1.5 mL，其中，微生物所需微量元素由接種污泥本身所含液所提供.該合成污水初始TN、NH+4-N分別為137.8和121.0 mg · L-1.

　　2.2 實驗方法

　　2.2.1 不同形式Fe(Ⅲ)脫氮效果的對比實驗

　　采用厭氧恒溫培養實驗，取6個系列100 mL血清瓶(每個系列包括9個瓶)，加入上述人工配水，分別投加1 g(以鐵氧化物質量計)不同形式Fe(Ⅲ)，置于高壓滅菌鍋內，于121 ℃下滅菌20 min，放至無菌室進行冷卻，嚴格按無菌操作法接種經厭氧處理((30±1)℃下密封7 d)后的上述接種污泥，同時設置滅菌的活性污泥(CK1)(用15%(V/V)的乙醇浸泡隔夜)(Ivanov et al., 2010).最后定容至80 mL，充氮排氧，控制混合液初始pH在7.2±0.2左右.各組均加蓋密封，于(30±1)℃恒溫培養箱中避光培養.所有測試均3次重復.

　　2.2.2 鐵還原過程中發生NH+4氧化的證實實驗

　　以氧化鐵皮作為鐵還原菌唯一電子受體，采用如上實驗方法，延長培養時間以追蹤過程中NO-2和NO-3濃度的變化，并計算Fe(Ⅱ)產生量與NH+4氧化量之間關系.

　　2.3 取樣及測定方法

　　由于活性污泥異化Fe(Ⅲ)還原產生的Fe(Ⅱ)既可以解離態的形式存在又可以吸附態的形式存在，因此，實驗中采用0.5 mol · L-1鹽酸溶液對懸液浸提測定體系的二價鐵和三價鐵的方法，并分別以Fe(Ⅱ)tot及Fe(Ⅲ)tot表示.具體方法如下：每次采樣時各取出1瓶，充分搖勻，各取試樣兩份.其中一份用于Fe(Ⅱ)和Fe(tot)濃度的測定，即吸取2 mL懸液，置于含8 mL(0.5 mol · L-1)鹽酸溶液的帶蓋聚乙烯離心管中，在搖床上振蕩浸提1 h(Stabnikov et al.，2004);另取一份(10 mL)用于NH+4-N及TN的測定.均在1500 r · min-1的轉速下離心10 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾.各指標的測定均采用標準法(國家環境護總局，2002).Fe(Ⅱ)及Fe(tot)測定采用鄰菲啰啉分光光度法，TN測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法，NH+4-N測定采用納氏試劑比色法，NO-2-N測定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法，NO-3-N測定采用麝香草酚法，pH測定采用便攜式多參數(pH/Oxi 340i)測定儀.

　　3 結果與討論

　　3.1 不同Fe(Ⅲ)源對活性污泥異化鐵還原能力的影響

　　厭氧條件下IRB的富集培養實驗中，投加不同Fe(Ⅲ)體系中Fe(Ⅱ)tot及Fe(Ⅲ)tot濃度變化如圖 2所示，其中，初始Fe(Ⅱ)tot濃度為(16.71±1.47)mg · L-1.由圖 2可見，對照組(CK1)的Fe(Ⅱ)tot及Fe(Ⅲ)tot濃度基本保持不變，這說明其它體系中所發生的Fe(Ⅱ)tot及Fe(Ⅲ)tot濃度變化是由 IRB作用而產生.0~7 d，不同Fe(Ⅲ)受IRB異化還原而解離出的Fe(Ⅱ)tot濃度大致呈線性增加，表現出較好的鐵還原能力，其中，Fe(OH)3、氧化鐵皮、青礦及紅礦的Fe(Ⅱ)tot最大產生率分別為19.24、17.51、11.65、9.83 mg · L-1 · d-1，與Fe(Ⅲ)源的含鐵量呈較好的正向關系;而在 7~13 d Fe(Ⅱ)tot濃度均呈現快速下降趨勢，13 d后基本穩定.值得注意的是，圖 2b中氧化鐵皮體系中Fe(Ⅲ)tot的濃度在前7 d呈現持續下降的趨勢，之后持續增加，16 d后其體系中Fe(Ⅲ)tot濃度已超過 Fe(OH)3體系.說明氧化鐵皮是一種較易被微生物利用的 Fe(Ⅲ)源形式.

　　圖 2 不同Fe(Ⅲ)源對活性污泥鐵還原過程中Fe(Ⅱ)tot及Fe(Ⅲ)tot濃度的變化

　　累計培養7 d后體系中Fe(Ⅱ)tot濃度呈現持續下降的趨勢，這可能是由于以下原因導致：①據相關報道(朱維晃等，2011; Benner et al., 2002)，在微生物還原過程中有磁鐵礦產生的現象發生，生成磁鐵礦的同時消耗體系中的Fe(Ⅱ)，導致Fe(Ⅱ)濃度顯著下降.將參加反應的礦物相經XRD分析，磁鐵礦的生成可用反應式2FeOOH+Fe(Ⅱ)→FeⅡFeⅢO4+2H+表示.②結合圖 2可以看出，累計培養7 d后，除對照組(CK1)外，其它體系中Fe(Ⅱ)tot濃度均出現快速下降趨勢，與此同時，Fe(Ⅲ)tot均出現不同程度的升高，尤其是氧化鐵皮 與Fe(OH)3體系，出現了Fe(Ⅲ)tot濃度急劇升高的現象.結合體系NH+4-N、TN 的變化，可以推測7 d后體系中厭氧氨氧化作用積累的NO-3可能促進了NO-3-依賴型Fe(Ⅱ)氧化(Nielsen et al., 1998; Ratering et al., 2001)作用的發生，將產生的Fe(Ⅱ)進一步氧化為Fe(Ⅲ).③由于實驗采用的人工配水中含有一定磷酸鹽，而磷酸根和解離態鐵生成的Fe-P結合物進一步會形成更穩定態的閉蓄態磷(邵興華，2005).

　　3.2 不同Fe(Ⅲ)對異化鐵還原過程中的脫氮效果影響

　　3.2.1 對脫氮效果的影響

　　對不同Fe(Ⅲ)還原體系中NH+4-N及TN去除效果進行分析，結果如圖 3a和3b所示.其中，NH+4-N、TN初始濃度分別為(117.25±8.45)和(133.49±8.11)mg · L-1，對照組(CK1)的NH+4-N及TN基本沒有變化，而實驗組出水NH+4-N、TN濃度呈緩慢降低的趨勢.根據NH+4-N、TN濃度的變化，可將整個過程分為3個階段：0~10 d，各體系脫氮效果無明顯差異，波動較大;10~16 d，不同Fe(Ⅲ)體系對NH+4-N、TN的去除均呈現下降趨勢，而氧化鐵皮體系脫氮效果略好，NH+4-N、TN濃度分別由初始的110.25、129.58 mg · L-1降至68.56和76.47 mg · L-1;最后一階段，氧化鐵皮體系脫氮性能顯著提高，最終NH+4-N及TN的去除率分別達到73.65%、74.76%.其中，氧化鐵皮體系NH+4-N、TN累計去除量最大，分別為75.04和80.99 mg · L-1，容積TN去除率為3.88 mg · L-1 · d-1(以N計)(圖 3c).

　　圖 3 投加不同Fe(Ⅲ)異化還原過程中的脫氮效果比較(a.氨氮; b.TN; c.累計去除量)

　　Clement等(2005)研究發現，在無亞硝酸鹽存在的前提下，Fe(Ⅲ)的存在能夠導致沉積物和土壤中厭氧氨氧化(ANAMMOX)現象的發生，可能是由于Fe3+/Fe2+的標準氧化還原電位為770 mV，而氧則為816 mV，兩者電化學性能相近，若體系中所含的細菌具有合適的酶系統(如Geobacter sulfurreducen和Aeromonas hydrophila在缺氧條件下能夠利用Fe(Ⅲ)作為電子受體(Bond et al., 2003; Pham et al., 2003))，則Fe(Ⅲ)能夠代替氧作為電子受體接受電子.與此同時，已有研究發現厭氧環境下NO-3和NO-2的生物還原伴隨著Fe(Ⅱ)的氧化，即NO-3-依賴型Fe(Ⅱ)氧化(Ratering et al.， 2002).因此，活性污泥鐵還原條件下的脫氮原因可能是綜上所述多種生物還原復合作用的結果.

　　3.2.2 培養過程中NO-2和NO-3濃度的變化

　　為進一步考察厭氧環境中鐵氨氧化作用對體系脫氮能力貢獻的大小，以氧化鐵皮為Fe(Ⅲ)源，通過實驗跟蹤培養過程中NO-2和NO-3的變化，并定量分析了NH+4氧化量與Fe(Ⅱ)生成量之間的關系，對體系實際NH+4/Fe(Ⅱ)摩爾比與鐵氨氧化作用的理論值進行了比較.

　　在初始無NO-2存在的前提下，追蹤鐵還原過程中NO-3和NO-2濃度的變化，結果如圖 4所示.可見，隨著培養時間的延長，厭氧條件下體系中發生異化鐵還原的同時發生了較好的脫氮效果，且出現了NO-2的短暫積累.NO-2-N濃度隨培養時間的延長呈升高趨勢，當累積培養至13 d，NO-2-N濃度由初始值(未檢測出)增加至0.251 mg · L-1，達到峰值;維持至第15 d，NO-2-N濃度迅速下降至穩定;至45 d，NO-2-N濃度出現第2個峰值.而NO-3-N濃度基本呈持續上升的趨勢，這與Wooshin 等(2005)的研究結果相一致.由于反應體系為厭氧體系，因此，可排除硝化作用產生NO-2、NO-3的可能，由此可以推斷，初始接種體系未檢測出NO-2、NO-3的存在，而培養過程中發生兩種基質濃度的積累現象，充分說明了異化鐵還原條件下能夠發生NH+4的氧化.

　　圖 4 活性污泥鐵還原過程中基質濃度隨培養時間的變化

　　3.3 機制探討 3.3.1 NH+4氧化與Fe(Ⅱ)產生變化關系

　　根據鐵氨氧化反應式，NH+4氧化量與Fe(Ⅱ)產生量之間的理論化學計量比為1：6，為考察鐵還原過程耦合NH+4氧化作用所占的比例大小，對培養過程中NH+4氧化量與Fe(Ⅱ)tot產生量之間分別按線性和冪指數方程進行了回歸分析，結果見圖 5.可見，不同培養時間內NH+4氧化量與Fe(Ⅱ)tot產生量更符合冪指數關系，R2為0.9521.另外，從圖中還可以看出，實驗測得的NH+4/Fe(Ⅱ)tot摩爾比與理論值(0.1667)相比要大的多，即鐵還原過程中還原產生一定量Fe(Ⅱ)的同時所氧化的NH+4要比理論值高，這說明體系中NH+4的氧化不僅是由鐵氨氧化作用導致，而且存在其他的反應過程.由于異化鐵還原耦合NH+4氧化的同時會產生NO-2，產生的NO-2進一步可與NH+4發生ANAMMOX現象，消耗一部分NH+4-N.由此可以推測，該體系可能會發生ANAMMOX現象.

　　圖 5 NH+4氧化量與Fe(Ⅱ)tot產生量之間變化關系

　　3.3.2 從熱力學角度分析

　　反應的吉布斯自由能是判斷各類氧化還原反應能否自發進行的依據，表 2給出了異化鐵還原體系中可能發生的氧化還原反應式標準吉布斯自由能.由此可以判斷各反應在該體系中均有可能發生.

　　表2 可能發生的氧化還原反應式標準吉布斯自由能變化

　　3.3.3 活性污泥異化鐵還原條件下的C-Fe-N耦合作用機制

　　結合上述關于體系中Fe(Ⅱ)、NH+4-N及TN 濃度的變化及分析，對活性污泥異化鐵還原體系C-Fe-N耦合作用機制作如下推測，結果見圖 6.

　　圖 6 厭氧環境下活性污泥異化鐵還原條件下的C-Fe-N交互作用機制示意圖

　　根據上述的脫氮效果及原因分析，活性污泥異化鐵還原條件下的脫氮體系中可能存在以下4個反應過程.①鐵氨氧化作用(過程I)：早在1997年，Luther等(1997)在富錳海底沉積物中發現，當典型的硝化/反硝化途徑短路時，NH3和有機氮分別在好氧、缺氧條件下在MnO2還原的同時氧化NO-3為N2;Clement等(2005)在富鐵河岸沉積物中初次證明了Fe(Ⅲ)作為電子受體同時氧化NH+4為NO-2的過程為產生能量的生物過程;之后也出現了在豬場廢水(Wooshin et al., 2005)、濕地土壤(Junu et al., 2009; Wendy et al., 2012)等存在鐵還原條件下的厭氧氨氧化過程方面的報道.結合圖 4，厭氧條件下無NO-2、NO-3存在的前提下，NO-2的短暫積累不可能是由硝化菌作用導致.然而當反硝化作用停止在NO-2水平，會有NO-2積累現象發生，但無法產生NO-3(Hulth et al., 1999).因此可以說明，異化鐵還原條件下能夠發生NH+4的氧化.②厭氧氨氧化作用(過程II)：厭氧條件下異化Fe(Ⅲ)還原過程中發生NO-2和NO-3的積累現象，同時伴隨著良好的脫氮效果.假設體系中的脫氮效果僅由鐵氨氧化作用導致，則異化鐵還原過程中會發生NH+4-N的去除，但對TN無明顯的去除效果.此外，由圖 5可知，NH+4/Fe(Ⅱ)摩爾比實驗值較理論值要大，說明產生的NO-2進一步與NH+4發生ANAMMOX作用，根據Trimmer等(2003)報道，包含細胞合成在內的ANAMMOX過程在生成N2的同時也產生一定量的NO-3.③NO-3-依賴型Fe(Ⅱ)氧化(過程Ⅲ)：該過程是在厭氧條件下以Fe(Ⅱ)為唯一電子供體，異化還原硝酸鹽的生物過程.Straub等(1996)報道了中溫菌的硝酸鹽依賴性Fe(Ⅱ)氧化，這些反硝化菌利用Fe(Ⅱ)作為電子供體還原硝酸鹽.Nielsen等(1998)在活性污泥中發現該現象的發生，對脫氮除磷具有很好的去除能力，同時得出最大Fe(Ⅱ)依賴型硝酸鹽還原率為0.31 mmol · g-1 · h-1.近年來，其作用機理引起了人們的關注，Carlson等(2012)從平衡電子攝取和脫毒方面闡明了厭氧NO-3-依賴型Fe(Ⅱ)氧化的作用機制.厭氧環境下的活性污泥異化鐵還原體系具備了NO-3-依賴型Fe(Ⅱ)氧化作用發生的所有條件，由此可以推斷該反應發生的可能性，然而對這一過程的發生還有待在今后做更深一層的研究.④Fe(Ⅲ)的水解作用：Fe(Ⅲ)先溶解和吸水，生成三價水合離子Fe(H2O)63+，同時，Fe(H2O)63+ 的水解反應引發一系列不同形態單核絡合物的形成，進一步縮合形成多核絡合物Fen(OH)m(3n-m)+(n>1，m=3n)(阮復昌等，1998).

　　城市污水廠的活性污泥體系是一個龐大的多種微生物和廢水中營養物質構成的復雜食物鏈，因此，厭氧環境下的異化鐵還原體系不僅為鐵還原菌、厭氧氨氧化菌提供了良好的生長環境，同時由于基質中含有足夠的Fe(Ⅱ)和NO-3，這可能也為NO-3-依賴型Fe(Ⅱ)氧化提供了反應發生的可能.關于異化Fe(Ⅲ)還原過程中發生脫氮效果的作用機制等方面的準確解釋，將會基于不同菌屬的富集培養、跟蹤特征指標的濃度變化，甚至同位素示蹤等方面開展更深一層的研究.具體參見污水寶商城資料或http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。

　　4 結論

　　1)IRB對不同形式Fe(Ⅲ)的利用情況不同，更容易利用比表面積大的非晶體及溶解態鐵(如Fe(OH)3)，研究表明，氧化鐵皮是一種較易被微生物還原的廉價的Fe(Ⅲ)源，可以替代常用的Fe(OH)3，并能達到以廢治廢的目的.

　　2)異化鐵還原過程中脫氮效果與產生的Fe(Ⅱ)及Fe(Ⅲ)濃度具有較好的關聯性，其中，氧化鐵皮體系脫氮性能顯著，最終NH+4-N及TN的去除率分別達到73.65%、74.76%.NH+4-N、TN累計去除量分別為75.04和80.99 mg · L-1，容積TN去除率為3.88 mg · L-1 · d-1.

　　3)從各反應的標準吉布斯自由能變化角度來看，厭氧環境下異化鐵還原條件下可能偶聯發生鐵氨氧化作用、厭氧氨氧化作用及NO-3-依賴型Fe(Ⅱ)氧化反應，共同作用導致體系具有較好的脫氮性能.其中，以IRB為主的鐵氨氧化作用占主要地位.