隨著工業的高度發展，環境污染日益加重。工業廢棄物中的硫化物會嚴重污染水體和空氣，越來越受到人們的關注[1-3]。傳統的脫硫方法運行費用高､二次污染較重，迫使技術人員尋求低能耗､高效率和無污染的脫硫方式[4]。生物脫硫是一項生物和環境領域的交叉學科技術，其優點是設備要求較低､操作條件溫和(無需高溫､高壓和添加催化劑等)且無二次污染，被認為是一種綠色脫硫技術，具有很好的應用潛力[5-7]。
然而目前國內外無色硫細菌脫硫仍處于初始研究階段，脫硫效果不理想，工業化程度不高[6，8]。其主要原因可歸納為脫硫反應器運行效果不理想缺乏以及該類脫硫微生物較為特殊的生理生化特性使得在脫硫過程的受到限制性因素影響較大[9，10]。大部分的工業廢水成分復雜，常含高濃度的有機污染物和重金屬離子，在一定程度上抑制化能自養型的脫硫微生物的生理活性，降低脫硫效率[11]。因此，探索該類微生物對不同有機物和重金屬離子的耐受特性也非常重要。此外，研究表明，菌種的保藏不當和頻繁的傳代容易使微生物的活性降低，出現退化現象，造成不必要的經濟損失[12]。因此，尋求高效簡易的菌種保藏方法也很有必要。
本實驗采用篩選于發電廠污水池的典型脫硫菌株HalothiobacillusneapolitanusCYJN-1(H.neapolita-nusCYJN-1)脫除硫代硫酸鹽過程為研究對象，分別考察在氣升式反應器的脫硫效果和動力學､對不同有機物和重金屬離子的耐受性以及最佳保藏方法，為生物脫硫提供一定的理論基礎。
1 實驗材料和方法
1.1 實驗菌種及來源
本研究所采用菌種為Halothiobacillusneapolita-nusCYJN-1，實驗室保藏[13]。
1.2 培養基
富集培養基:Na2S2O3·5H2O10.0g，K2HPO44.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4· 7H2O0.8g，NH4Cl0.4g，微量元素10mL，蒸餾水1000mL。調節初始pH至7.0。
微量元素溶液成分:Na2EDTA50g，ZnSO4·7H2O22.0g，CaCl25.54g，MnCl2· 4H2O5.06g，FeSO4·7H2O4.99g，(NH4)6MO7O24· 4H2O 1.10g，CuSO45H2O1.57g，CoCl2·6H2O1.61g，蒸餾水1000mL。
1.3 內循環氣升式反應器
本實驗采用內循環氣升式生物脫硫反應器，有機玻璃材質，反應器總容積約700mL，工作容積為500mL，其外徑和高度分別為5cm和30cm。氣體是由空氣泵產生，通過導流筒將反應器內氣-液-固相接觸并充分混合，更好地實現培養體系的鼓泡混勻和氧傳質。該反應器結構簡單､供氣效率高，利于單質硫的生成和分離。
1.4 實驗方法
1.4.1 H.neapolitanusCYJN-1脫硫性能分析
選用較為穩定的還原態硫源———Na2S2O23為唯一能源底物，脫硫體系為水相的培養基。在30℃､通氣量為360mL/min條件下培養56h，定期檢測pH､S2O2-3 濃度､單質硫產量和生物量。
1.4.2 CYJN-1對有機物和金屬離子耐受性研究
分別向培養基添加1%和3%的不同有機物(醇類-甲醇､乙醇､丙三醇和異丁醇;酸類-甲酸､乙酸､乳酸和正丁酸)，最適條件下培養40h，測定生物量和S2O2-3 含量。
1.4.3 CYJN-1有機物和金屬離子耐受性研究
分別向培養基中添加0.1g/L和0.5g/L濃度的Cu2+､Zn2+､Mn2+､Cd2+､Pb2+､Cr2+和Ni2+等重金屬離子，最適條件下培養40h，測定生物量和S2O2-3 含量。
1.4.4 菌種保藏實驗
低溫保藏方法優選:將菌種培養至對數生長期，2000r/min離心2min除去沉淀，8000r/min離心10min將菌液濃縮至107cells/mL作為保藏液。分別按以下方法在不同溫度下(4℃､-20℃ 及-40℃)保藏。濃縮后的菌液;采用新鮮培養基懸浮濃縮后菌液;采用無菌水直接懸浮濃縮后的菌液;采用15%的甘油懸浮濃縮后菌液。將所保藏的菌液隔1個月后接種于新鮮培養基中，測定其存活率。
考察5種保藏方法中短期保藏過程對細胞存活率影響。反復培養保藏:將菌種培養至對數生長期，轉接至新鮮培養基繼續培養。低溫保藏:如新鮮培養基懸浮保藏所述，每隔3個月重新培養保藏。平板保藏:將菌種接種于固體平板上培養4d，將含平板封口置于4℃保藏。甘油保藏:將滅菌的終濃度為15% 的甘油加至對數生長期的菌液中，置于-40℃下冷凍保藏。冷凍干燥保藏:將對數生長期的菌液濃縮100倍，放置離心管中迅速抽真空冷凍于-40℃下保藏。
1.5 分析方法
1.5.1 菌種生物量(CFU)測定
采用平板活菌計數法測定。將對數期的菌液離心去除大顆粒沉淀，8000r/min離心5min濃縮菌體。測定600nm吸光值，根據吸光度與CFU之間標準曲線計算菌落數量。
1.5.2 硫代硫酸鈉濃度的測定
采用碘量滴定法測定[14]，步驟如下:配制稀釋溶液:取1mL的培養液用水稀釋至50mL(稀釋50倍)。在碘量瓶中放入50mL的溶液，分別加入2mL17.5mol/L醋酸和1mL1% 的淀粉溶液。用0.01mol/L濃度的碘液滴定至出現不消失的藍色為止，滴定所消耗的碘量來計算S2O2-3 的含量。計算公式如下:
式中:Y為所含S2O2-3 的量，mg/L;C是滴定的碘液濃度，為0.01mol/L;M 是S2O2-3 的分子量為11250是所加溶液的體積，為50mL;X是稀釋倍數;VV0為滴定是所消耗的碘液體積。
1.5.3 單質硫的測定
單質硫的檢測采用硫平衡法，公式如下:
式中:△CS2O23-為硫代硫酸鹽濃度的減少量;△CSO24-為硫酸鹽濃度的增加量，反應式如下:S2O2-3 +0.5O2 =S0 +SO2-4 ，S0 +2O2 =SO2-4 。單質硫檢測和定量測定:高效液相色譜法(HPLC)結合元素守恒定律[15]。具體參見http://www.jianfeilema.cn更多相關技術文檔。
1.5.4 比生長速率和比消耗速率分析
菌種比生長速率(μx)和底物比消耗速率(μs)計算如以下方程式:μx為比生長速率(h-1)，μs為比消耗速率(×10-3 g/(cells·h))，X0 和S0 為初始時生物量(cells/mL)和底物濃度(g/L);Xt和St為測樣時生物量(cells/mL)和底物濃度(g/L)。
